摘要
骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种常见的代谢性骨疾病，在骨折发生之前一般不易察觉。据世卫组织报道，全世界患有OP的人群超过2亿。OP已经成为我国乃至全球的一个威胁人类生命安全健康的重大公共卫生问题。全面深入地研究OP发病机制以改善预防和治疗的措施是减轻社会医疗健康系统重担的当务之急。虽然与OP相关的血液学和免疫学研究已经非常深入，但是现有的大多数研究都是基于细胞群体水平上的探索，只能获得群体细胞的平均表达水平，从而忽略细胞之间的差异对OP的影响。单细胞转录组测序技术(Single cell RNA sequencing,scRNA-seq)可以获得单个细胞水平上的基因表达，有利于揭示OP相关免疫细胞亚群和基因。PBMC亚群及其中基因表达与OP的关系尚未应用scRNA-seq技术进行系统评估。 目的： 通过scRNA-seq技术揭示外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)在不同个体中的异质性，并绘制PBMC图谱;寻找OP相关的细胞亚群，分析与OP相关的PBMC亚群中差异表达的基因,从而系统全面地探讨PBMC和OP之间的关系，加强对OP的认识。本研究在理论基础上为进一步开展PBMC的基因与OP的关联和机制研究提供支撑。 方法： 本研究采集了 6名OP患者和4名对照者的新鲜外周静脉血5ml,从中提取PBMC进行scRNA-seq。对测序返回的原始数据使用CellRanger软件进行人类基因组比对、样本聚合等操作获得细胞表达矩阵。使用R软件进行下游的数据分析。首先，对测序数据进行质量控制，去除低质量的细胞。其次，进行样本整合和降维聚类分群，对聚类出的各个细胞集群（clusters）进行细胞注释，并使用轨迹分析展示细胞间的分化轨迹;计算出各细胞亚群中病例对照组间差异表达基因。最后，对差异表达基因进行富集分析;使用基因集评分方法评估病例对照组间的细胞状态差异;通讯分析获取细胞间配受体对的交互作用在病例对照组中的差异。 结果： 10个PBMC样本的单细胞测序数据集进行质控后剩余97 366个细胞，对其降维聚类分群检测出18个clusters,并注释为11种细胞亚群，包括:CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、NK细胞、增殖细胞、B细胞、浆细胞、单核细胞、树突状细胞、浆细胞样树突状细胞和巨细胞。OP患者的单核细胞百分占比高于对照组。 细胞亚群差异基因的功能富集分析发现，单核细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞等都在破骨细胞分化（Osteoclast differentiation）上高度富集。单核细胞细分为三种单核细胞亚型:CD14+单核细胞（又称经典单核细胞）、CD16+单核细胞（或非经典单核细胞）和中间单核细胞。中间单核细胞数量百分比在病例对照组间存在差异（P=0.021）,表明OP组个体血液PBMC中的中间单核细胞数量有所升高。中间单核细胞在OP组上调的基因主要有HLA-DRB1、CST3、CD52、PTL和RETN等,下调的基因有 CCL3L1、IER2、CCL4L2、TNFAIP3、CCL3、NFKBIA、CXCL8、CCL4、HLA-DQA2、DUSP1、KLF6、HLA-DRB5、NFKBIZ、JUN 和 TNF 等。这些差异表达基因在氧化磷酸化通路和Ⅰ型干扰素反应通路中富集;在GSVA的富集结果中，如干扰素反应、KRAS下调信号通路、IL2_STAT5信号通路等与OP密切相关的通路在OP组中上调。 T细胞的亚型中，CD4+GZMK效应T细胞高表达ZFP36、LYZ和CXCR4等;CD8+GZMK效应T细胞高表达DUSP2、CTSW、MT2A和CXCR4等;γδT细胞高表达 PTGDS、CD247、DUSP1 和 KLRC1;NKT 细胞高表达 LAIR2 和 CD7 等。NK 细胞高表达LAIR2、IFI44L、MYOM2、IFITM1、IFI6和MT2A等。除了原始和记忆T细胞，各细胞亚群间的细胞毒性、耗竭和炎症反应评分都是OP组高于对照组。此外,原始和记忆B细胞都显著高表达HLA-DRB1。 OP组中的CD8+效应T细胞分别与CD4+效应T细胞、中间单核细胞以及CD16+单核细胞之间相互作用的总数和权重/强度都高于对照组。CD8+效应T细胞的MIF分子与中间单核细胞中的CD74和CD44相互作用在OP组中增强。 结论： 1.本研究通过对PBMC进行scRNA-seq,成功注释出14种T细胞和NK细胞、3种单核细胞和3种B细胞亚型，并揭示了 PBMC的异质性。 2.单核细胞、T细胞和NK细胞可能通过上调与破骨细胞的形成和分化密切相关的多种基因和通路参与OP的调控。 3.T细胞与单核细胞间的相互作用增强，提示OCs分化的重要上游通路被高度激活，骨吸收速度增加从而导致OP。
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