摘要
坦布苏病毒（Tembusuvirus,TMUV）属于黄病毒科黄病毒属，在我国鸭群中广泛流行，是目前影响家养水禽的主要病原之一。TMUV不仅可以通过蚊媒传播，还可以脱离蚊媒通过直接接触和气溶胶等多种方式在鸭间高效传播，最近研究发现，TMUV宿主范围不断扩大，而且能够感染多种人源细胞系，可能对哺乳动物健康造成了巨大威胁。研究表明，早期鸭TMUV分离株不能通过鼻腔感染小鼠，而近期分离到一株鸭TMUVHB株可以通过鼻腔感染并致死小鼠，然而其对小鼠致病的分子机制尚不清楚。 为了探究TMUV对小鼠致病性差异的分子基础，我们将HB株与已报道的坦布苏病毒的全基因序列进行比对，发现HB在E和NS3蛋白上分别含有一个特异的氨基酸:326K和519T,其它TMUV均为326E和519A。为了研究这两个氨基酸对HB株神经侵袭力和神经毒力的影响，本研究利用坦布苏病毒反向遗传操作技术以HB为骨架拯救得到三株突变病毒:两个单突变病毒（smHB-E326ENS3519T和smHB-E326KNS3519A）和一个双突变病毒（dmHB-E326ENS3519A），我们以小鼠为模型评估了突变病毒和亲本病毒的神经侵袭力和神经毒力。将病毒经鼻腔接种小鼠后，小鼠体重变化曲线显示，感染wtHB-E326KNS3519T的小鼠与其它组小鼠相比，体重出现明显的下降，wtHB-E326KNS3519T和smHB-E326KNS3519A分别造成了80％和20％的死亡率，并且脑内检测到较高滴度的病毒，而E蛋白发生K326E突变后，smHB-E326ENS3519T和dmHB-E326ENS3519A感染组小鼠没有出现任何临床症状，脑内也未检测到病毒。这些结果表明，E蛋白K326E突变使TMUVHB株完全丧失了对小鼠的神经侵袭性，同时T519A突变也使HB的神经侵袭性减弱，表明E-326K和NS3-519T共同导致了HB株对小鼠的神经侵袭性，其中E-326K占主要作用。为了进一步比较不同病毒对小鼠的神经毒力，将病毒通过脑内接种小鼠后，低剂量的wtHB-E326KNS3519T可以100％致死小鼠，半数致死量为101.5TCID50,而发生K326E突变后，即使将smHB-E326ENS3519T的感染剂量提高1000倍仍不能导致小鼠死亡，同时dmHB-E326ENS3519A的半数致死量比smHB-E326KNS3519A也提高了5-6倍。脑组织病毒含量检测发现，wtHB-E326KNS3519T、smHB-E326KNS3519A和dmHB-E326ENS3519A感染组小鼠脑组织比smHB-E326ENS3519T组具有更高的病毒载量。另外，小鼠体重变化曲线显示，以102.0和103.0TCID50的剂量脑内接种病毒的小鼠，在感染后第4天，各组小鼠体重均出现明显下降，然而在感染后第7天，只有接种smHB-E326ENS3519T的小鼠体重逐渐恢复。这些结果表明，E-326K是决定TMUVHB对小鼠神经毒力的关键氨基酸。 为了进一步探究326K影响TMUV毒力的分子机制，我们观察了小鼠在病毒感染后不同时间点的脑内病理变化并且检测了脑内病毒载量以及炎性细胞因子的表达量，发现在感染后6d和8d，接种wtHB-E326KNS3519T的小鼠脑内诱导更强烈的炎性反应，血管周围存在大量炎性细胞浸润，出现血管袖套现象，而接种smHB-E326ENS3519T的小鼠在感染后8d，脑内炎性反应明显减弱。此外，炎性细胞因子检测结果显示，接种wtHB-E326KNS3519T的小鼠在感染后6天和8天，脑内IL-1β，IL-6、IL-8和TNF-α的表达量明显高于smHB-E326ENS3519T感染组。因此，wtHB-E326KNS3519T可能通过引起脑内过度的炎性反应从而导致了小鼠的死亡。由于wtHB-E326KNS3519T和smHB-E326ENS3519T在小鼠脑内的复制水平不一致，为了证明这些差异是由E-326K决定的，而不是由病毒复制差异导致的，我们用smHB-E326KNS3519A和dmHB-E326ENS3519A两株复制水平相当的突变病毒进行了验证，发现结果是相一致的。这些结果表明，含有326K的病毒感染小鼠可以引起小鼠脑内过度的炎性反应，从而增强了HB株对小鼠的神经毒力。另外，从mRNA水平和蛋白水平对小鼠脑内IFN-α/β表达量的分析结果显示，wtHB-E326KNS3519T诱导的IFN-α/β表达量明显高于smHB-E326ENS3519T。为了验证Ⅰ型IFN是否促进了HB对小鼠的神经毒力，将IFN-β在病毒感染后3天和5天经脑内接种小鼠，结果显示，IFN-β加速了wtHB-E326KNS3519T组小鼠的死亡，并且接种smHB-E326ENS3519T的小鼠经脑内注射干扰素后，也导致了40％的死亡率，说明Ⅰ型IFN在HB对小鼠的致病过程中起到了一定的促进作用。以上结果表明，过度的炎性反应伴随Ⅰ型IFN的大量表达共同导致了野生型HB对小鼠的神经毒力。 为了探究野生型HB株刺激机体产生大量促炎性细胞因子和Ⅰ型IFN的通路，我们检测了小鼠脑内RIG-I,MDA5,TLR3,TLR7,IRF3和IRF7的表达水平。结果显示，wtHB-E326KNS3519T诱导的RIG-I转录水平明显高于smHB-E326ENS3519T，并且MDA5的转录水平也存在明显的差异，smHB-E326KNS3519A和dmHB-E326ENS3519A之间也具有相似的趋势。Westernblotting的结果显示，感染wtHB-E326KNS3519T的小鼠脑内RIG-I蛋白表达量明显升高，而smHB-E326ENS3519T组三只小鼠均未出现特异性条带。进一步结果显示，接种wtHB-E326KNS3519T的小鼠脑内刺激的IRF7水平也显著升高，而IRF3水平无明显差异。这些结果表明，E-326K对于wtHB-E326KNS3519T在小鼠脑中激活RIG-I-IRF7通路至关重要。 本研究明确了TMUV对小鼠致病性差异的分子基础，初步探索了TMUVHB导致小鼠发病的分子机制，为进一步研究TMUV对哺乳动物的致病机理奠定了基础，同时也揭示了TMUV对哺乳动物的潜在风险。
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