摘要
L-异亮氨酸属于支链氨基酸，在人和动物的代谢过程中起着不可替代的重要作用。目前L-异亮氨酸的生产主要通过依赖苏氨酸途径的微生物发酵法实现，但受限于苏氨酸途径合成通路的冗长及代谢调控机制的复杂，使得L-异亮氨酸的产量始终处于较低水平。除苏氨酸途径外，自然界中还存在有多条其他 L-异亮氨酸生物合成途径，其中基于丙酮酸途径的 L-异亮氨酸生物合成步骤少，调控简单，是苏氨酸途径的理想替代途径，但目前还没有应用该途径生产L-异亮氨酸的报道。基于此，本研究选择大肠杆菌为底盘细胞，在优化基因编辑方法的基础上，首次构建了基于丙酮酸途径的大肠杆菌L-异亮氨酸细胞工厂。结果如下： 在大肠杆菌中建立并优化了CRISPR-Cas9及Transposon-encoded CRISPR-Cas系统。首先利用CRISPR-Cas9成功实现了ilvA、tdcB基因的敲除。但在尝试敲除brnQ、livJ基因时，尽管更换了多个gRNA及使用了1500 bp的长同源臂，但依旧未能成功。因此，在大肠杆菌MG1655（DE3）中引入了Transposon-encoded CRISPR-Cas系统，并对其进行优化，将该系统由原始的三质粒系统整合为双质粒系统，提高了其编辑效率和稳定性。单基因敲除效率最高可达 100%，多基因编辑效率也可达到70%以上。 通过敲除ilvA基因，构建了大肠杆菌L-异亮氨酸营养缺陷型菌株。利用MG1655ΔilvA突变株，对cimA基因的表达进行了优化，成功在大肠杆菌中初步构建了丙酮酸途径。设计了以PT7、PJ23100做为启动子的cimA表达质粒和基因组整合策略，结果显示，基因组整合策略不足以产生足够的L-异亮氨酸用于菌株生长。而在质粒上过表达的cimA基因由于拥有不同启动子其达情况差异也较大。以PJ23100作为启动子的过表达质粒菌株的生长有一定的恢复。以上结果表明，通过优化表达cimA构建的丙酮酸途径在大肠杆菌中具有合成L-异亮氨酸的能力。 在表达 cimA 基因的基础上，对丙酮酸途径进行了进一步系统优化。利用前期构建的Transposon-encoded CRISPR-Cas系统敲除ldhA、adhE，阻断乳酸、乙醇合成通路，提高前体物丙酮酸的供给。敲除转运蛋白livJ、brnQ并过表达brnEF、ygaZH，降低L-异亮氨酸在细胞内的积累。对丙酮酸途径中的关键基因进行了筛选，并构建了过表达质粒。获得的工程菌株进行了摇瓶发酵，结果显示，过表达leuDH基因对L-异亮氨酸生产的提升效果最明显，最终菌株的L-异亮氨酸产量最高可达387 mg/L。 综上，本研究首次构建了基于丙酮酸途径的大肠杆菌L-异亮氨酸生产菌株，并依靠CRISPR-Cas9及Transposon-encoded CRISPR-Cas系统对丙酮酸途径进行了系统优化，获得的突变株展现出良好的生产性能。本研究为利用丙酮酸途径生产 L-异亮氨酸提供理论依据，对提升 L-异亮氨酸的生产水平、促进其工业应用具有重要的理论和现实意义。
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