摘要
研究目的:牙周炎是一种由细菌诱导的慢性破坏性疾病，它能够引起牙周支持组织持续的炎症状态，驱动免疫细胞介导的牙周软硬组织自我降解，最终导致牙周骨缺损、牙齿脱落的结局。引导组织再生(guidedtissueregeneration，GTR)和引导骨再生(guidedboneregeneration,GBR)是恢复牙周组织和颅颌面骨健康和功能的重要再生方法，它将GTR/GBR膜覆盖在骨缺损区作为机械屏障，阻止牙龈和结缔组织侵入骨再生区，同时维持成骨空间，引导牙周软硬组织修复。然而，目前临床上常用的引导组织再生膜或支架的抗菌和成骨性能仍显不足，无法满足临床治疗要求。随着组织工程技术的发展，可降解的多功能仿生GTR/GBR支架颇具研制前景。因此，我们提出应用高压静电纺丝技术和可降解高分子材料，复合具有成骨作用的锌掺杂的纳米轻基磷灰石(Zincdopedhydroxyapatite，Zn-HA)和具有抗菌作用的姜黄素-铜螯合物(Curcumin-coppercomplex,Cur-Cu),形成双层非对称性的仿生支架载药系统，通过研究支架体外抗菌抗炎促成骨性能和牙龈愈合能力，应对“炎症-成骨”复杂微环境，以期成为有潜力的组织工程支架。 研究方法:通过沉淀法和配位螯合法分别制备锌掺杂的纳米羟基磷灰石和姜黄素-铜螯合物并进行物化性能表征，通过CCK-8实验和ELISA实验筛选出载入支架的最适药物浓度。通过高压静电纺丝技术，以PLGA(PolyLactic-co-GlycolicAcid)和PCL(Polye-Caprolactone)为基质并掺杂Zn-HA制备骨接触层;以PCL和明胶(Gelatin)为基质并掺杂Cur-Cu制备牙龈接触层，二者顺序组装制备得到双层支架PP(Zn-HA)/PG(Cur-Cu)。对双层支架进行了表面形貌、力学性能和Cur释放效果评估，并进行抗菌、抗炎、成骨和对牙龈愈合作用的体外研究:1)通过活死染色研究支架对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果;2)通过ROS检测、凋亡分析与免疫荧光染色进一步分析支架在MC3T3-E1与巨噬细胞模拟炎症环境中的抗氧化与抗炎作用;3)通过ALP检测和茜素红染色评估支架对炎症诱导MC3T3-E1细胞的早期和后期成骨效果。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹法检测支架共培养细胞中黏附(整合素α5、整合素β1)和成骨标志物(BMP-2、RUNX2)的表达水平，研究材料对炎症环境下MC3T3-E1细胞成骨分化的影响;4)通过荧光共聚焦显微镜观察牙龈成纤维细胞在对应的支架表面的黏附状态，通过划痕实验研究细胞迁移，并检测迁移相关基因包括粘着斑激酶和I型胶原的表达。使用倒置显微镜观察血管内皮细胞HUVECs在不同支架处理后的成管行为动向，对VE-钙粘着蛋白进行免疫荧光染色观察，评价支架早期血管化能力。 研究结果:1)成功制备了锌掺杂的纳米羟基磷灰石以及姜黄素-铜螯合物，通过CCK-8和ELISA实验分别确定以1％(w/w)Zn-HA和5μg/mlCur-Cu的浓度载入支架。所制得PP(Zn-HA)/PG(Cur-Cu)支架的骨接触层和牙龈接触层均具备类细胞外基质的高孔隙空间结构，具有较高的杨氏模量和抗断裂性能，并能缓释姜黄素。在体外抗菌实验展现出了对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌良好的抗菌效果;2)成功模拟了MC3T3-E1细胞的炎症状态，PP(Zn-HA)/PG(Cur-Cu)能够抵抗因过量ROS造成的氧化应激，将细胞凋亡率降低至接近对照组水准;还能够调控巨噬细胞向M2型极化;3)ALP、茜素红染色、qPCR和WesternBlot均证明了该支架能够明显促进炎症环境中MC3T3-E1的成骨分化;4)免疫荧光染色和划痕实验发现牙龈成纤维细胞在牙龈接触层PG(Cur-Cu)表面可更轻松地黏附攀行，qPCR结果证实PG(Cur-Cu)处理24h后，牙龈成纤维细胞中粘着斑激酶和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平增加;5)成管实验发现PP(Zn-HA)/PG(Cur-Cu)处理后HUVECs的成管趋势更加显著，同时VE-钙粘着蛋白CD144高表达。 结论:高压静电纺丝制备出的非对称双层PP(Zn-HA)/PG(Cur-Cu)支架在体外具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化性能，优异的成骨性能和良好的牙龈愈合作用。这种新型的非对称双层支架有望成为有潜力的牙周组织工程支架，在牙周炎治疗中有效对抗菌斑微生物和牙周炎症的破坏作用，并发挥骨保护作用，为牙周炎骨缺损区骨细胞增殖分化提供三维生长微环境，有效促进骨再生。
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