摘要
酶作为一种绿色高效的生物催化剂在工业应用中展现出了独特优势，因其通常需要承受高温或长时间的孵育过程，对天然稳定酶的热适应机制研究和不稳定酶的分子设计是目前酶学研究的前沿领域。但由于不同酶种之间甚至同一酶种不同家族成员之间的序列、结构与功能等方面存在巨大差异，导致酶的热稳定性主导机理尚无统一定论。α-淀粉酶作为研究最多、生产最早、产量最大、应用最广的工业酶种之一，累积了极其丰富的包括一级序列、三级结构和酶学性质等多维数据。本研究旨在以α-淀粉酶为研究对象，从酶的不同结构层面以及内在进化驱动力等方面展开研究，揭示其热适应性分子进化规律，为酶的热稳定性分子设计奠定理论基础。 为了阐明α-淀粉酶的一级序列与其热适应性的进化规律，构建了涵盖最适温度为20–105℃的α-淀粉酶及其序列-结构-热稳定性数据库。按最适温度划分，中温酶(30–50℃)和高温酶(50–80℃)的占比分别为40%和33%，处于两个极端的超嗜热酶(＞80℃)和低温酶(＜30℃)的占比相当，分别为12%和15%，分布相对合理。对氨基酸组成与最适温度之间的相关性进行统计分析，结果表明：随着最适温度的提高，α-淀粉酶中天冬酰胺的含量极显著降低(P=1.7×10-5)，酪氨酸的含量极显著增高(P=9.9×10-5)，带电氨基酸的含量显著上升(P=0.01)。选取Streptococcus equinus来源的α-淀粉酶SEA(最适温度40℃)和Bacillus licheniformis来源的超嗜热α-淀粉酶BLA(最适温度90℃)为材料对该机理进行验证。将SEA中与BLA差异的天冬酰胺、酪氨酸及带电残基进行对应突变，共获得了14个Tm值提高的突变体，单点突变提高幅度可高达4.7℃。 数据库中最为典型的材料是来自极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的α-淀粉酶PfAmy，其最适温度为100℃。以PfAmy为出发材料，通过系统进化分析，成功挖掘到一个与PfAmy序列一致性高达88.6%但热稳定性差异显著的Thermococcus eurythermalisα-淀粉酶TeAmy(最适温度为85–90℃)。通过结构分析和结构域替换，发现结构域A和C影响了α-淀粉酶的热稳定性，但不显著，而把PfAmy的结构域B替换至TeAmy可将最适温度提高至100℃，说明结构域B是PfAmy超嗜热的决定性因素。进一步研究发现结构域B中的残基His152、Cys166和His168是关键残基，通过疏水相互作用网络稳定了结构域B中的离子腔从而导致整体结构稳定。获得的耐热突变体K152H/A166C/E168H在pH5.5和105℃的条件下对淀粉液化效果要优于PfAmy。 基于上述研究，我们推测结构域B是α-淀粉酶热稳定性的“木桶短板”。为了验证这一假设，将超嗜热淀粉酶BLA的结构域B替换至中温酶SEA中，获得的嵌合酶SEB其Tm值较SEA提高了12.5℃，初步验证了这一理论的普适性。在此基础上，基于氨基酸对共进化的原则，采用结构预测模型Transformer-MSA构建了高精度的α-淀粉酶热稳定性共进化模型，并对嵌合酶SEB进行突变体设计以探究在补齐短板后的热稳定性改造效果。通过在SEA和SEB相同位置进行氨基酸定点突变，结果表明：补齐短板后的嵌合酶SEB相关突变体的热稳定性提升效果显著优于SEA，成功率分别为70.6%和35.3%，其中SEB突变体的Tm值提高幅度可高达8.5℃，而对应位点在SEA中突变并没有显著改变Tm值。此结果证实了α-淀粉酶的结构域B是整个结构的“短板”，将其优化后可显著提升酶热稳定性分子改良的效果。 目前工业上应用较多的α-淀粉酶均来自厚壁菌门的芽孢杆菌属，其在长期的高温环境进化过程中形成了独特的热适应性进化规律。通过异源表达来源于厚壁菌门的8个α-淀粉酶(最适温度横跨40–90℃)，并在不同温度下测定动力学稳定性。结果表明：酶的Km值均随着温度的上升而上升，当温度高于酶最适温度时，Km值骤升。在测量范围内(30–100℃)，最适温度高的酶Km值普遍低于最适温度低的酶。说明热稳定性好的α-淀粉酶在高温下与底物之间具有更大的亲和力，从而有助于其在高温下发挥功能。此外，通过拟合阿伦尼乌斯公式发现，比热容ΔCp的非零变化引起了酶催化速率与温度之间的非线性关系，ΔCp沿系统发育树，随着酶的最适温度升高而升高，表明ΔCp是α-淀粉酶热适应性进化的内在驱动力。 本研究以素材丰富的α-淀粉酶为材料，构建了α-淀粉酶及其序列-结构-热稳定性数据库，从一级序列层级揭示了天冬酰胺、酪氨酸和带电氨基酸含量与酶最适温度之间的相关性；发现了结构域B是超嗜热酶耐热性的决定因素，阐明了其分子机理并指导获得了可应用于淀粉液化工艺的超耐热酶突变体；提出了结构域B是α-淀粉酶热稳定性的“木桶短板”理论，将其优化后可显著提升酶热稳定性分子改良的效果；基于动力学稳定性和系统进化分析阐释了比热容ΔCp是α-淀粉酶的热适应性进化驱动力。研究成果为认知酶对环境变化的适应性和进化轨迹提供了重要支撑，为酶的热稳定性分子改造提供了新的思路和方法。
NETL