摘要
禽致病性大肠杆菌（Avian Pathogenic Escherichia coli）是革兰氏阴性菌，其感染可引起家禽腹膜炎、输卵管炎等症状，对养禽业造成的经济损失大。APEC复杂的致病机制和广泛的耐药性是制约其有效防控的关键因素。调控 APEC 致病机制和耐药性产生的因素众多，包括 c-di-GMP （cyclic diguanylate）、群体感应系统（quorum sensing，QS）和双组分系统等。其中，生物被膜（Biofilm）是引起APEC耐药性增加的主要原因。c-di-GMP由含有GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶（DGCs）产生，并被特定的含有EAL/HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（PDEs）降解，细菌可通过DGCs与PDEs调控胞内c-di-GMP水平，从而调控其多种生物学功能，特别是生物被膜形成和致病性的产生。 DgcI是禽致病性大肠杆菌c-di-GMP合成酶之一，但其对APEC的调控作用尚不清楚，本研究通过构建dgcI缺失株和GST-pulldown等方法，探究dgcI对APEC生物学特性的影响及调控机制，可为基于c-di-GMP调控开展APEC防控提供参考。本研究结果如下： 1. 禽致病大肠杆菌dgcI基因缺失株构建及生物学特性分析 为验证dgcI的调控功能，本研究通过双荧光报告系统证实DgcI具有c-di-GMP合成酶活性，构建了APEC菌株DE17（本实验室分离保存，血清型为O2血清型）的dgcI基因缺失株DE17ΔdgcI及其回补株DE17CΔdgcI。对缺失株与野生株的生物学特性分析，结果表明dgcI缺失不影响APEC生长及其耐药性，但显著降低DE17的生物被膜形成（p＜0.05），运动能力显著升高（p＜0.05），表明dgcI参与调控APEC生物被膜的形成。 为进一步研究dgcI在APEC在感染宿主过程中的调控作用，分别选择DF-1细胞和鼠结肠癌细胞MC38，比较DE17ΔdgcI和DE17在入侵、黏附宿主细胞以及对STING信号通路的影响。结果表明dgcI缺失不影响APEC对DF-1细胞的粘附/入侵能力, 但dgcI基因缺失后，STING的转录水平显著升高（p＜0.05）,表明 dgcI可能在APEC感染宿主过程中通过STING通路发挥调控作用。 2. 禽致病性大肠杆菌DgcI互作蛋白筛选、鉴定及其对生物被膜形成的影响 为研究dgcI缺失影响APEC生物被膜降低的分子机制，本研究通过构建DgcI原核表达载体pGEX4T-2-DgcI，成功表达大小为79kDa的DgcI重组蛋白，并通过磁珠法进行pull down 联合质谱鉴定，最后得到DgcI可能的互作蛋白300个左右。 选取与糖代谢、甘油代谢等重要生理过程相关的蛋白45个，通过细菌双杂交系统，将DgcI和候选蛋白分别克隆至BTH101中，通过IPTG和X-gal指示平板，验证其是否互作。结果鉴定与DgcI互作的蛋白3个，分别为：3-磷酸甘油脱氢酶（GlpD）、c-di-GMP环化酶(DgcP)、组氨酸激酶（NarX）。 为验证筛选的DgcI的互作蛋白（GlpD、DgcP、NarX）是否参与APEC的生物被膜形成，构建其单基因与双基因缺失株，分别命名为 DE17ΔdgcP、DE17ΔdgcIΔdgcP、DE17ΔglpD、DE17ΔdgcIΔglpD、DE17ΔnarX、DE17ΔdgcIΔnarX。对上述菌株生物被膜形成能力测定结果表明， dgcI 缺失（ DE17ΔdgcI ）显著降低 DE17 生物被膜形成能力（ p＜0.01 ） ，但仅双缺失株DE17ΔdgcIΔglpD可显著恢复DE17ΔdgcI的生物被膜形成水平（p＜0.05），表明DgcI通过与GlpD互作，调控APEC生物被膜形成。 3. dgcI参与禽致病性大肠杆菌甘油代谢影响生物被膜形成的分子机制 为研探究DgcI与GlpD的互作结构域，构建了DgcI与GlpD蛋白的4个截短体，细菌双杂交验证结果表明，DgcI蛋白需要两个结构域GAPES2和GGDEF结构域同时存在才能与GlpD蛋白碳端的氧化酶结构域互作。为进一步鉴定 DgcI 与 GlpD 的互作位点，通过随机突变技术将 dgcI 的开放阅读框（ORF）进行随机突变，细菌双杂交验证结果表明21Ala、25Gly、91Leu、114Tyr、164lle、179Phe、279Phe、289Tyr、352Lys、400lle、422Met和425Asp 10个氨基酸位点可能是DgcI与GlpD互作的关键位点。 GlpD 参与细菌的甘油代谢，为进一步明确 DgcI 调控 GlpD 影响 APEC 生物被膜形成的机制，本研究通过靶向代谢组学技术，对单缺失株DE17ΔdgcI和双缺失株DE17ΔdgcIΔglpD的甘油代谢与三羧酸循环代谢产物进行定量，结果表明，dgcI 缺失降低大部分产物的含量，但 dgcI 与glpD的同时缺失恢复了葡萄糖、GTP、ATP的含量，推测可能是DE17ΔdgcIΔglpD菌株生物被膜形成能力恢复的原因。 本研究结果表明，DgcI具有c-di-GMP合成酶活性，DgcI可通过与GlpD互作，调控APEC生物被膜形成，本研究可为基于c-di-GMP调控开展APEC防控提供参考。
NETL