摘要
目的： CRISPR技术基于碱基互补配对激活原理可实现对目标物质的高灵敏和特异性分析，在生物传感器的构建和生物大分子的分析检测中展示出了巨大应用潜力。我们拟结合DNA纳米技术的优势，在CRISPR-Cas的基础上发展新型生物传感系统实现外泌体蛋白的检测分析。（1）以分裂式G-四链体介导的ThT荧光增强为信号输出手段，结合Cas12a响应体系，构建免标记生物传感系统。结合适配体对蛋白质的特异性识别作用，实现对外泌体表面蛋白的检测分析。（2）利用Cas12a和Cas13a分别降解单链DNA和单链RNA的特性，设计开发了一种Cas12a与Cas13a正交双响应体系，结合两种适配体实现对外泌体蛋白的有效识别，可同时实现双靶标检测，有效增加外泌体表面蛋白的检测效率。 方法：课题一：通过差速离心法以分离纯化得到不同肿瘤细胞分泌的外泌体，再以磁珠相连的适配体来识别外泌体表面蛋白进一步分离出外泌体，适配体可以激活CRISPR-Cas12a体系去切割底物链从而影响分裂式G-四链体纳米装置荧光信号的产生，进而来检测并分析肿瘤细胞所分泌的外泌体。此外还优化了基于分裂式G-四链体响应型CRISPR-Cas12a体系的检测条件，并最终将该体系运用于临床病人血清外泌体的检测分析中。 课题二：通过分离纯化不同肿瘤细胞的外泌体，利用磁珠相连的两条适配体识别外泌体表面蛋白，随后靶标会从适配体上分离出来从而来激活Cas12a与Cas13a，进而对荧光底物链切割产生荧光信号。本课题对检测温度、检测时间进行了优化，最后对临床样本进行了测试分析。 结果：课题一：（1）我们成功收集了肿瘤细胞来源的外泌体，并用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy ， TEM ）和纳米粒子追踪分析仪（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）进行了表征。（2）成功设计并开发了G-四链体响应型Cas12a检测体系，并对检测条件进行了优化，提高了灵敏度和特异性；（3）高浓度K+条件下，Cas12a的反式切割活性受到抑制，为以G-四链体作为Cas12的底物进行信号输出奠定了基础；（4）与传统的G-四链体介导的CRISPR信号输出不同，我们通过分裂式G-四链体，引入Link链，可对目标物质实现浓度正相关响应；（5）利用Cas12a对底物非特异性降解，实现了信号放大，对目标外泌体检测限低至258.8 particles/mL。（6）该检测方法在生物基质中表现良好，这使其能够用于临床血清样本的检测。 课题二：（1）我们提出并验证了正交 Cas12a与Cas13a双响应检测体系的可行性，并对相关实验条件进行了优化。（2）该方法通过双适配体捕捉外泌体提高了检测的准确性，相较于其他的检测方法操作更加便捷。（3）研究了该体系的通用性，当检测其他蛋白质时，只需改变相应蛋白的适配体即可。（4）该检测方法在生物基质中表现良好，也能够用于临床血清样本的检测。 结论：我们成功构建了两种生物传感器，并能用于外泌体检测。两种检测方法均表现出灵敏度高和特异性强的优点，且可用于临床样本分析。
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