摘要
酮病是围产期奶牛高发的一种营养代谢性疾病，长期影响奶牛的繁殖性能。酮病奶牛血液中以 β-羟基丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHBA）为代表的高浓度酮体（Ketone bodies，KBs）会进入卵泡液（Follicular fluid，FF）影响颗粒细胞（Granulosa cells，GCs）和卵泡的发育，继而导致奶牛发情活动减少、产后第一次发情时间延长等低繁殖力表现。然而，FF 中高浓度的BHBA对卵泡 GCs的影响及其调控机制仍不清楚。因此，本研究首先利用 RNA-seq技术和生物信息学分析鉴定了 GCs 在不同浓度 BHBA 应激下的差异表达基因（ Differential expression genes，DEGs）及其功能；然后进一步利用分子生物学手段揭示了高浓度 BHBA 对奶牛卵泡GCs 影响机制；最后探究了外泌体（Exosomes，Exos）在恢复高浓度 BHBA 应激下颗粒细胞增殖率中的作用，解析了FF来源的Exos microRNAs（miRNAs）对GCs增殖的可能调控机制。主要研究内容如下： 1、BHBA对奶牛卵泡GCs增殖的影响及相关机制的初步探索 首先评估了0 mM、1.2 mM和2.4 mM BHBA应激对奶牛卵泡GCs增殖和细胞周期的影响，结果发现 1.2 mM和 2.4 mM 的 BHBA应激导致 GCs细胞周期阻滞在 G1期，GCs增殖异常。RNA-seq结果表明DEGs被聚类到8个不同趋势的表达谱（Profiles）中，其中profile 1和6中的DEGs对1.2 mM的BHBA已经有响应，profile 3和4中的DEGs在BHBA浓度达到2.4 mM时才有响应，profile 0和7中的DEGs对BHBA浓度增加有相同表达趋势。GO和KEGG功能富集分析结果表明1.2 mM BHBA可能抑制了细胞周期，而2.4 mM BHBA则更易诱导GCs凋亡；此外随着BHBA浓度的持续增加，雌激素合成可能受阻。 2、BHBA对奶牛卵泡GCs线粒体功能的影响及其相关机制的研究 进一步研究发现 2.4 mM BHBA 应激导致牛 GCs 凋亡率、线粒体活性氧（Mitochondrial reactive oxygen species, mitoROS）水平显著升高。同时，研究发现2.4 mM BHBA应激导致线粒体功能障碍，包括 GCs 线粒体异常率增加，线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放，线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）降低和Ca2+释放。而过表达线粒体去乙酰化酶Sirtuin 3（Sirt3）可通过AMPK-mTOR-Beclin-1通路增强卵泡GCs的自噬，从而缓解BHBA诱导的线粒体损伤。 3、奶牛卵泡液Exos miRNA 调控卵泡GCs增殖的机制研究 奶牛卵泡液Exos与GCs共孵育结果表明可以显著增加GCs的增殖率。通过 miRNA-seq技术在酮病奶牛与非酮病奶牛的卵泡液Exos中共鉴定到95个差异表达的miRNA（76个上调和19个下调）。进一步研究发现 bta-miR184 可能在卵泡 GCs 增殖中起到了重要的调控作用，并对其调控的靶基因进行 GO和 KEGG功能富集分析发现：bta-miR184可能参与了代谢、氧化还原平衡的调节以及Notch信号通路等。 本研究从多维度阐明了酮病奶牛 FF中高浓度 BHBA诱导 GCs损伤的分子机制，研究为提高酮病奶牛繁殖率提供了理论基础，同时也为卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）、多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）等卵泡发育受阻相关的疾病研究具有借鉴意义。
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