摘要
玉米（Zea mays）作为三大主粮作物之首，其稳产和增产是保障粮食安全的基础。籽粒是玉米品质的重要体现，其质量的好坏直接影响玉米产量和营养元素的供给。挖掘玉米籽粒发育相关基因并解析其功能，为人们更清晰的了解籽粒发育过程提供帮助，同时为高产优质玉米的遗传改良提供理论支持。本研究以8个玉米籽粒发育缺陷突变体（defective kernel，dek）为研究材料，整合基于表型的转录组差异表达基因分析和已知籽粒性状QTLs位点，筛选到一个籽粒发育相关基因 AGS1，另外定位一个引起籽粒突变表型的基因 CNS1并对其功能进行解析。主要研究结果如下： 1、从UniformMu突变体库中鉴定到编号为UFMu-06493的突变体和另外7个籽粒发育缺陷突变体，与对应的野生型相比，我们发现所有成熟突变体籽粒均变小，种皮皱缩。然后对这 8个突变体进行表型分离比例的统计，卡平方（x2）检验结果表明遗传类型均符合 WT∶mutant = 3∶1的单基因隐性核遗传。 2、对其中 7个突变体材料，分别取每一个突变体材料有表型分离的果穗，选择 10 DAP和18 DAP 的野生型和突变体籽粒进行石蜡切片。结果显示同一个材料中突变体籽粒的胚和胚乳发育均明显滞后于野生型。不同材料之间的野生型籽粒发育基本一致，而突变体籽粒的发育则有明显差别。进而，对7个突变体材料分别进行Bulk segregant RNA-seq（BSR-seq）初定位，结果显示与表型连锁的区域位于7个染色体不同位置，表明是由7个不同的基因突变产生的表型。 3、对上述转录组数据进行差异表达基因分析（DEG），根据一个 DEG在 7个不同比较组中出现的频次，分为 1到 7频次，去除表达变化方向不一致的基因后获得 2513个基因。为增加筛选的可靠性，保留出现 3 频次及以上共有 846 个目标基因。进一步将这些候选基因与已有的籽粒粒型、粒重相关的QTLs进行联合分析，发现284个基因落在QTLs内部，表明这些基因可能为QTLs贡献表型变异。选取284个基因中一个7频次下调表达的基因作为可能参与籽粒发育的候选基因，其编码ATPases Associated with Diverse Cellular Activity (AAA-ATPase) 蛋白。对该基因两个纯合突变体籽粒粒型和粒重进行测量，其结果均显著低于野生型对照，并且两个纯合突变体之间互交 F1籽粒表型也表现出相同的下降趋势。因此，将该基因命名为 ATPase related to grain size (AGS1)。 4、另外利用 BSR-seq、图位克隆和染色体步移的方法对 UFMu-06493 突变体进行分析，定位引致籽粒发育缺陷表型的候选基因—Zm00001d002771，并且通过转基因过表达互补和等位点杂交验证了基因克隆的正确性。根据后续的基因功能分析结果，将其命名为 cytochrome c maturation FN stabilizer1（ZmCNS1），蛋白质结构预测结果表明该基因编码P-型三十五肽重复蛋白，亚细胞定位实验表明CNS1在线粒体中发挥功能。 5、为深入研究CNS1的功能，首先利用透射电镜观察突变体cns1幼嫩籽粒，发现细胞内的线粒体出现畸形和破裂。进一步利用 BN-PAGE分离线粒体不同复合体并进行活性检测实验，结果显示cns1中线粒体复合体Ⅲ的组装和活性受到严重影响。根据进化树分析结果提示CNS1可能发挥稳定线粒体转录本的功能。因此通过cRT-PCR检测突变体和野生型籽粒中与复合体Ⅲ相关的四个转录本 ccmC，ccmB，ccmFC和 ccmFN的完整性是否受到影响。结果显示，突变体中ccmFN转录本的 5′末端发生截短，缺少了应有的起始密码子，提示缺少末端保护的 ccmFN转录本，其完整性受到了影响。借助MST和EMSA实验证明CNS1蛋白能够直接结合ccmFN转录本5′末端AUG上游317 nt的单链RNA序列。以上结果表明CNS1通过直接结合ccmFN的5′末端序列，保护其转录本的完整性。 综上所述，该研究利用7个籽粒发育缺陷突变体的转录组分析和QTLs位点进行联合分析，筛选得到一个影响籽粒发育的基因 AGS1，为挖掘籽粒发育相关基因供了一个新方法；定位并解析 CNS1的生物学功能，对于维持线粒体 ccmFN的完整性和复合体Ⅲ的功能具有重要作用，为籽粒发育和线粒体基因 5′末端完整性之间存在的系统且严密的调控作用提供了更多分子和遗传学证据。
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