摘要
核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),是由储存、传输和表达遗传信息的核苷酸组成的天然生物聚合物，核酸的异常表达和过度表达与多种疾病相关。早期疾病标志物的含量往往很低，而且一种疾病往往和多种疾病标记物相关，因此，具有高灵敏度、高特异性、低成本和便捷等特点的疾病标志物检测平台对于重大疾病和重大传染病的早期诊断、预防与治疗具有重要意义。 以下为本文研究内容: (1)利用EXPAR快速、高效和微流控的高通量、多通路特点，实现了对乳腺癌三种异常表达的miRNAs同时、高灵敏度、高特异性检测。传统的恒温扩增对目标物进行信号放大易出现非特异性扩增，导致假阳性信号。该研究为降低非特异性扩增，将EXPAR的扩增模板设计为发夹结构，提高对目标物的选择性，从而降低假阳性信号。设计改进后的EXPAR模板被目标物触发后会产生大量触发子，触发子与荧光探针结合生成荧光报告复合物，实现目标物的信号产生和放大。生成的荧光报告复合物与修饰在微流控基底上的捕获探针结合后产生荧光信号。该研究在微流控芯片实现了多种目标物的同时检测，灵敏度达到了 aM级别，且具有较好的特异性，为临床诊断提供了一种有前景的检测平台。通过实际样品的测试，进一步证明构建的微流控生物芯片在早期癌症诊断中具有良好的实际应用能力，为癌症标志物检测方面提供了新思路。 (2)微流控芯片满足多路复用、溶液用量小、制造方便且成本低的特点，在微流控芯片上巧妙设计的纳米结构实现标志物的检测。该纳米结构由适配体(包含S1和S2)和聚合酶两部分构成，当不存在目标物时，聚合酶活性处于被抑制状态，不发挥聚合作用;当目标物存在时，目标物与适配体的S2结合，导致纳米结构解离，释放S1和聚合酶，聚合酶活性恢复，使S1和捕获探针结合后的产物延伸生成双链。该研究充分且巧妙地利用了纳米结构的各组成部分，纳米结构具有识别目标物、提供延伸模板和辅助延伸工具的功能，纳米结构的功能和利用率大大增强，实现了芯片检测全过程的集成。该微流控芯片检测装备在室温25℃下即可正常进行，更重要的是时间可以控制在1h以内，大大节约了检测时间。 (3)为进一步探索微流控芯片上纳米材料的性能，提高玻璃基底对探针的负载量,我们设计合成了 MOF材料Ni-IRMOF-74-Ⅱ。该MOF材料呈均匀针状和规则六边形空隙，可以起到增加结合位点、提高探针负载量、保护DNA链的作用。当DNA探针与MOF材料结合时，MOFs发挥猝灭作用，荧光基团标记的DNA探针荧光被迅速猝灭。在目标miRNA存在的情况下，荧光团标记的DNA从MOF材料中释放，实现MOFs和ssDNA之间的可逆相互作用，基于此可用于构建荧光猝灭-恢复微流控检测芯片。 最后，本文基于微流控芯片的重大疾病核酸标志物多重荧光检测研究为同时检测多种疾病标记物提供了有效的方法，在早期临床诊断中具有广阔的应用前景，对疾病的及时发现和准确诊断起到了积极作用。
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