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非洲哈茨木霉ACCC 33109抑菌挥发性物质鉴别及合成酶基因研究
非洲哈茨木霉ACCC 33109抑菌挥发性物质鉴别及合成酶基因研究
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中文摘要:
生防真菌非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC33109产生的挥发性有机化合物(Volatile Organic Compounds,VOCs)可以抑制尖孢镰刀菌等病原菌的生长,推测其抑菌活性组分主要为萜类物质。本论文以ACCC33109为研究材料,整合基因组分析和萜类合成酶基因表达水平预测与抑菌VOCs合成相关的基因,通过基因敲除技术构建突变株,基于基因型和表现型比较分析野生株和突变株的VOCs代谢组和抑菌活性差异确定关键基因,并通过异源表达、蛋白纯化和法尼基焦磷酸盐环化反应产物的质谱分析确定抑菌VOCs,从而解析ACCC33109抑菌VOCs的关键组分及相关合成酶基因,主要结果如下: 1、ACCC33109基因组共有40,667,101个碱基对组成,G+C含量为47.05%,预测11,022个编码基因,其中有9,827个基因参与KEGG代谢途径,包括54个次级代谢基因簇(645个基因)、10个萜类合成酶基因簇(57个基因)和10个家族细胞色素P450(176个基因)。在尖孢镰刀菌隔空诱导条件下,基于RT-qPCR分析发现ACCC33109的10/15个萜类合成酶基因上调表达,其中Ta.ts04858较对照上调高达3400倍,可能是ACCC33109抑菌VOCs合成的关键酶基因。 2、为确定ACCC33109抑菌VOCs合成酶关键基因,构建了高效的ACCC33109遗传操作系统,确定制备原生质体的最佳酶解条件为20mg/mL木霉裂解酶反应8h,用于突变株筛选的新霉素和潮霉素最适除菌浓度分别为400μg/mL和100μg/mL,并敲除DNA连接酶IV构建突变株ΔTalig4∷neo以提高非同源重组的转化率。以ΔTalig4∷neo为底盘菌,分别敲除4个高表达萜类合成酶基因,成功获得突变株ΔTalig4∷neoΔTats01643∷hph、ΔTalig4∷neoΔTats03322∷hph、ΔTalig4∷neoΔTats04858∷hph和ΔTalig4∷neoΔTats06313∷hph。 3、与底盘菌ΔTalig4∷neo相比,突变株ΔTalig4∷neoΔTats04858∷hph-3的VOCs抑菌活性下降(9%;P<0.001),除Ta.ts09488上调表达(32.5倍)外其他萜类合成酶基因均无差异或下调表达(0.05?1.14倍),VOCs的种类(39vs.13)和萜类物质含量(14.97%vs.1.02%)大幅下降,尤其是倍半萜类物质(11.71%vs.0.35%),且对Biolog FF微孔板的29种碳源和7种氮源代谢能力增强,表明Ta.ts04858是ACCC33109抑菌VOCs合成代谢中最关键的基因,其催化合成的倍半萜类物质是最重要的抑菌VOCs组分。 4、为挖掘Ta.ts04858的功能,构建重组质粒pET28a+-EcoRI-His6-SacI-TEV-HindⅢ-Tats4858-NotI并转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中实现异源表达。纯化的重组蛋白TaTS04858催化法尼基焦磷酸盐的环化反应生成双环的荜澄茄油宁烯(β-Cubenene)和微量的紫穗槐烯(γ-Amorphene),前者是ACCC33109VOCs的主要倍半萜化合物并具有广谱杀菌抑菌活性,进一步证明荜澄茄油宁烯是ACCC33109的主要抑菌VOC,其合成代谢由Ta.ts04858调控。 本研究从基因-蛋白-次级代谢产物三方面解析ACCC33109抑菌VOCs合成的关键基因、编码的萜类合成酶以及催化生成的抑菌VOCs物质。结果表明ACCC33109的萜类物质合成代谢存在同步或互补性,关键基因Ta.ts04858参与多种萜类物质的合成,尤其是倍半萜类的荜澄茄油宁烯。研究结果奠定抑菌性烯萜类VOCs的物质基础,加深木霉菌生防机制的理论认知,在挖掘木霉生防应用潜力方面具有重要意义。
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作者:
张芳
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关键词:
生物防治
非洲哈茨木霉
挥发性有机化合物
萜类合成酶
基因敲除
抑菌活性
授予学位:
硕士
学科专业:
微生物学
导师:
顾金刚
学位年度:
2023
学位授予单位:
中国农业科学院
语种:
中文
中图分类号:
S4