摘要
研究目的: 头孢地尔是一种新型的铁载体螯合的头孢菌素类抗菌药物，对革兰阴性病原体显示出强大的杀菌活性。不同种类的碳青霉烯酶对头孢地尔的水解能力有待研究。此外，细菌铁载体的产生是与毒力相关的重要因素，由于头孢地尔的结构特性，不同类型铁载体产生对其敏感性的影响是一个值得关注的问题。有关于头孢地尔的耐药性，目前临床数据有限，关于其耐药机制的研究也还处于初步探索阶段。本研究旨在探究铁载体的产生对头孢地尔敏感性的影响以及其耐药机制，为临床使用头孢地尔治疗泛耐药的革兰阴性病原体提供新思路。 研究方法: 本文首先在相同的遗传背景菌株中分别引入常见的三种不同类别的碳青霉烯酶，在体外头孢地尔压力选择下诱导其耐药性。通过全基因组测序和生信分析比对出差异基因，探究可能导致头孢地尔耐药性的机制并用pBAD33质粒回补实验和碳青霉烯酶抑制剂进行验证。使用CRISPR-Cas9系统敲除与铁载体合成相关的基因，并结合质粒的回补、过表达实验，共同验证铁载体合成对头孢地尔敏感性的影响。最后，通过实时荧光定量PCR对铁载体受体基因进行表达量的检测，进一步探究与头孢地尔耐药相关的机制。 研究结果: 1.把表达质粒导入ATCC43816构建产KPC、NDM、OXA等碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌后，头孢地尔对其仍有很强的抗菌活性，其中产NDM的菌株对头孢地尔的基线MIC高于KPC和OXA。在体外头孢地尔压力选择实验中，产NDM的菌株能够产生更高的MIC突变株。 2.在经历体外压力选择后，耐药株的碳青霉烯酶基因序列未发生突变，但表达量明显增高。在加入碳青霉烯酶抑制剂后，菌株对头孢地尔的MIC明显下降。 3.分别敲除了三种铁载体合成相关基因entB、iroB、ybtS后，只有entB缺陷株对头孢地尔的敏感性明显升高，进一步的基因回补和过表达实验结果也与之一致。证明肠杆菌素的合成与头孢地尔敏感性关系密切。 4.体外压力选择后的耐药株经全基因组测序分析后，发现有双组份系统基因envZ和baeS以及铁载体受体基因cirA的突变，经回补野生型后，菌株对头孢地尔的敏感性轻微恢复。 5.体外压力选择的耐药株中，除了产NDM菌株由于cirA突变造成了另两种儿茶酚酸盐类铁载体受体代偿性高表达以外，在产KPC和OXA菌株中，三种铁载体受体都是低表达，可能与头孢地尔耐药性相关。 研究结论: 1.碳青霉烯酶对头孢地尔的水解作用很微弱，但NDM相较于KPC和OXA对头孢地尔诱导耐药有着更强的潜力，且在诱导耐药中通过表达量增加发挥作用。 2.肺炎克雷伯菌产生的三种铁载体中，儿茶酚酸盐类铁载体肠杆菌素的缺失使菌株对头孢地尔的敏感性明显升高。 3.双组份系统基因envZ和baeS以及儿茶酚酸盐类铁载体受体基因cirA的突变使菌株对头孢地尔敏感性降低。 4.头孢地尔可能通过与肠杆菌素相同的受体Fiu，CirA,FepA进入周质。且在这三种受体中，CirA的作用更为重要。
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