摘要
背景 帕金森病（Parkinson''sdisease,PD）是临床上最常见神经退行性疾病之一，以运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势平衡障碍为主要运动症状，常见的非运动症状有抑郁、焦虑、便秘、睡眠障碍和认知障碍等。PD的关键组织病理学标志是中脑多巴胺神经元的变性坏死和路易小体（Lewybody，LB）的形成。迄今为止，PD的发病机尚未被阐明。约5％-10％的PD患者呈家族聚集性，为基因突变引起的遗传性PD。目前已定位包括SNCA、LRRK2、PRKN等在内的近30个遗传性PD致病基因。 Funayama团队首次提出，CHCHD2基因突变与常染色体显性遗传PD和散发性PD相关。本课题组在前期工作中发现并报道了中国大陆第一例CHCHD2基因突变的PD家系。CHCHD2基因的各种突变可见于家族及散发性PD、阿尔兹海默病（Alzheimer''sdisease,AD）和额颞叶痴呆（Frontotemporaldementia，FTD）等多种神经系统疾病。CHCHD2是一种多功能蛋白，在线粒体、细胞核、胞浆中均有分布。线粒体内，CHCHD2参与调节线粒体代谢和凋亡;同时，CHCHD2也可以在细胞核中调节编码氧反应元件ORE的基因转录。目前为止，CHCHD2基因突变导致PD的发病机制尚不清楚。 我们在前期工作中构建了首个CHCHD2p.Thr61Ile（T61I）knock-in（KI）小鼠模型，从生存情况、运动能力、组织病理及蛋白表达等多个方面进行研究，证实该动物模型很好模拟了CHCHD2突变相关PD的临床表型。蛋白组学联合免疫印迹验证发现，在CHCHD2T61I杂合型小鼠的黑质（Substantianigra,SN）和纹状体（Striatum,STR）组织中，可见共同差异表达蛋白胰岛素降解酶（Insulin-degradingenzyme,IDE）的表达水平显著降低。提示IDE可能参与CHCHD2相关PD的发病过程。IDE是一种多功能的锌依赖性金属蛋白酶，参与包括胰岛素、胰岛淀粉样多肽（Isletamyloidpolypeptide,IAPP）、胰高血糖素和淀粉样β肽（Amyloid-β,Aβ）等的分解代谢。此外，IDE还可发挥死亡伴侣、热休克蛋白、E1-泛素激活酶和蛋白酶体调节剂等非蛋白水解功能。既往研究表明，IDE参与AD的发病。目前，CHCHD2与IDE的关系以及IDE参与CHCHD2突变相关PD的机制尚不明确。 目的 本研究拟在前期工作的基础上探讨CHCHD2突变对IDE的影响，结合转录组测序，探讨CHCHD2调控IDE参与PD发病的可能机制。通过进一步在CHCHD2T61IKIPD小鼠中过表达IDE蛋白，研究其对疾病小鼠行为学、病理学等表型的治疗作用。 方法 1.通过WesternBlot检测CHCHD2T61I点突变小鼠脑组织和患者来源的诱导多能干细胞（Inducedpluoripotentstemcell,iPSC）中IDE蛋白水平变化;通过RT-qPCR检测杂合型点突变小鼠脑组织IDE转录水平变化;通过放线菌酮追踪实验检测CHCHD2T61I点突变对IDE蛋白稳定性的影响;通过免疫荧光共定位检测CHCHD2和IDE的共定位关系;通过免疫共沉淀检测CHCHD2与IDE的相互作用关系;通过siRNA转染技术，利用RT-qPCR检测敲低CHCHD2后IDE的变化。 2.通过转录组测序结合生物信息分析，获取CHCHD2T61I杂合型点突变小鼠黑质和纹状体中的差异表达基因。对差异表达基因进一步进行KEGG聚类分析，检测疾病模型中相关通路的变化。利用RT-qPCR对部分差异变化通路的关键分子进行验证。 3.构建携带IDE基因的AAV-PHP.eB载体，并在CHCHD2T61I点突变小的胡中实现IDE蛋白的过表达。应用转轮、爬杆、旷场和高架十字迷宫等行为学分析方法和免疫组化等分子生物学手段，分析IDE过表达对小鼠行为学及病理学的影响;通过线粒体透射电镜及ROS水平检测，分析IDE过表达对小鼠线粒体形态和功能的影响。 结果 1.在CHCHD2T61I点突变小鼠脑组织（p＜0.05）和PD患者来源iPSC（p＜0.05）中可见IDE蛋白水平降低。进一步验证IDE的转录水平，可见杂合型点突变小鼠黑质（p＜0.05）和纹状体（p＜0.05）中IDE转录水平下降;在HEK293T细胞中过表达CHCHD2T61I点突变质粒可降低IDE蛋白稳定性（p＜0.05）。小鼠脑组织中存在CHCHD2与IDE的共定位，与野生型小鼠相比，CHCHD2T61I点突变小鼠脑内CHCHD2和IDE共定位无明显变化。体外免疫共沉淀实验提示，CHCHD2与IDE之间可能不存在直接相互作用;在HEK293T细胞中敲低CHCHD2,可见IDE转录水平降低（p＜0.05）。 2.对CHCHD2T61I杂合型点突变小鼠和野生型对照小鼠黑质和纹状体进行转录组分析，结果提示:与野生型小鼠相比，CHCHD2T61I点突变杂合小鼠黑质中有91个差异表达基因，其中上调基因44个，下调基因47个;纹状体中有468个差异表达基因，其中上调基因295个，下调基因173个。对差异表达基因进行KEGG通路富集分析及RT-qPCR验证，发现与神经退行性疾病相关的ErBb信号通路（p＜0.05）、p53信号通路（p＜0.05）和HIF-1信号通路（p＜0.05）存在明显上调。 3.过表达IDE蛋白可改善CHCHD2T61I点突变小鼠的行为学、病理学表型及线粒体相关异常指标。注射携带IDE基因的AAV-PHP.eB载体后，疾病小鼠爬杆实验所需时间缩短、转轮实验掉落潜伏期延长，小鼠焦虑程度缓解。病理学结果提示，过表达IDE蛋白可减少多巴胺能神经元的死亡，缓解小鼠脑组织a-syn和p-a-synser129沉积。同时，过表达IDE蛋白后，疾病小鼠线粒体形态有改善趋势、脑组织ROS水平降低（p＜0.05）。 结论 1.CHCHD2与IDE关系密切，CHCHD2T61I突变可影响IDE表达水平及蛋白稳定性。CHCHD2蛋白与IDE之间存在共定位，但可能无直接相互作用关系。 2.ErbB信号通路、p53信号通路和HIF-1信号通路可能参与CHCHD2对IDE的调控。 3.IDE蛋白过表达对CHCHD2T61I点突变PD小鼠模型具有一定的神经保护作用。
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