摘要
背景:巨噬细胞（Macrophage,Mφ）是一群具有高度异质性及可塑性的免疫细胞，根据微环境和刺激信号的不同可极化为经典活化型（M1型）和替代活化型（M2型）。M1型具有抗肿瘤作用，而M2型具有促肿瘤作用。肿瘤相关巨噬细胞（Tumorassociatedmacrophages,TAMs）是指浸润在肿瘤微环境中的巨噬细胞，M2型是其主要极化形式，通过多种方式抑制肿瘤免疫反应进而加快肿瘤进展。基于TAMs的促肿瘤作用，靶向TAMs成为一种有效的抗肿瘤策略，其中包括调控TAMs的极化。不同表型的巨噬细胞的葡萄糖代谢方式存在显著差异，M1型主要利用糖酵解进行供能，M2型则主要依靠氧化磷酸化产生ATP。能量代谢是调控巨噬细胞极化的重要方面，葡萄糖代谢途径的改变能够调节巨噬细胞的极化，干预TAMs的糖代谢方式能够调控TAMs的极化。AD-1是一种新型人参皂苷衍生物，具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、免疫调节等多种作用，然而AD-1对TAMs极化的调节作用及机制尚不明确。 目的:旨在研究AD-1是否通过调控TAMs糖代谢进而影响其极化，为后续研究AD-1的抗肿瘤作用提供前期基础。 方法: 1.将小鼠结肠癌细胞CT26的培养上清液以50％的比例加入小鼠巨噬细胞RAW264.7中以模拟肿瘤微环境，并分为对照组和实验组（2.5、5、10μMAD-1组），培养24h后，流式细胞术检测其中M1型巨噬细胞百分比和M2型巨噬细胞百分比;RT-PCR检测Arg-1、TGF-β、IL-10、iNOS、TNF-α、IL-1β基因表达情况;Westernblot检测Arg-1、iNOS蛋白表达情况;ELISA检测细胞培养上清液中TGF-β、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达情况，评价TAMs极化情况。 2.AD-1处理TAMs后，检测其ATP生成和乳酸生成情况，Westernblot检测GLUT1、LDHA、PKM2、HK2的表达，评价AD-1对TAMs糖代谢的影响。 3.用糖酵解特异性抑制剂2-DG处理TAMs后，检测其ATP生成和乳酸生成情况，Westernblot检测GLUT1、LDHA、PKM2、HK2的表达;流式细胞术检测其中M1型巨噬细胞百分比和M2型巨噬细胞百分比;Westernblot检测Arg-1、iNOS蛋白表达情况;ELISA检测细胞培养上清液中TGF-β、IL-10、TNF-α、IL-1β表达情况，评价糖酵解抑制后，AD-1对TAMs极化的影响。 4.AD-1处理TAMs后，Westernblot检测AMPK、p-AMPK蛋白的表达;AMPK特异性抑制剂CompoundC处理TAMs后，Westernblot检测AMPK、p-AMPK蛋白的表达，检测其ATP生成和乳酸生成情况，Westernblot检测GLUT1、LDHA、PKM2、HK2的表达，评价AMPK低表达后，AD-1对TAMs糖代谢的影响。 结果: 1.流式细胞术结果显示，AD-1降低了肿瘤微环境中M2型巨噬细胞百分比，并且提高了其中M1型百分比;RT-PCR结果显示，AD-1减少了肿瘤微环境中M2型巨噬细胞相关细胞因子基因的表达，增加了M1型巨噬细胞相关细胞因子基因的表达;Westernblot及ELISA结果显示，AD-1减少了肿瘤微环境中M2型巨噬细胞相关细胞因子蛋白的表达，增加了M1型巨噬细胞相关细胞因子蛋白的表达。 2.AD-1增加了TAMsATP生成和乳酸的生成，并促进糖酵解关键酶的表达。 3.抑制糖酵解后，AD-1仍然可以使TAMs的糖酵解水平提高，M1型巨噬细胞百分比显著增加，M2型巨噬细胞百分比显著减少。 4.对AMPK检测的结果显示，AD-1增加了p-AMPK的表达;加入抑制剂后,AD-1仍然上调TAMs中p-AMPK的表达，糖酵解水平仍然显著提高。 结论:AD-1通过促进TAMs糖酵解调控其向M1型极化，这种对糖酵解的影响可能是通过激活AMPK实现的。
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