摘要
植物内生真菌在高等植物中普遍存在，具有丰富的多样性，由于宿主与环境的不同，其代谢产物也呈现丰富的化学多样性并受到广泛关注，许多内生真菌代谢产物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、杀虫活性，是天然活性产物的重要来源。紫苏Perillafrutescens（L.）Britt.是唇形科的一年生草本植物，广泛分布于中国、日本、韩国等东亚地区，其叶、茎、种子均可入药，紫苏叶还可食用。紫苏不仅具有抗过敏、抗抑郁、抗肿瘤和抗菌等多种生物活性，还具有较强的生长适应性和较好的重金属耐受性。多种内生真菌与紫苏存在共生关系，部分菌株具有促生、抗逆作用，并能产生具有生物活性的次生代谢产物。本研究以前期筛选得到的与抗逆相关的内生真菌菌株为研究对象，对其代谢产物及抗肿瘤、抗氧化生物活性进行研究，旨在明确其活性物质基础，对其代谢产物进行系统的分离和鉴定，为进一步开发利用紫苏功能菌株提供科学依据，同时也为深入解析植物与内生真菌之间的相互作用关系，丰富活性天然产物库以及药物开发和农业应用提供参考。 本文研究内容主要分成以下三个部分: 一、紫苏内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选 对从紫苏中分离得到的20株对重金属耐受性强的菌株制备发酵代谢产物并进行抗肿瘤活性筛选，初筛发现有11株菌株代谢产物对人肝癌细胞HepG2的生长具有较强抑制活性。进一步复筛获得菌株ZP-J8、BC-J4和BC-G1代谢产物对HepG2细胞和人前列腺癌细胞DU-145的增殖具有较强的抑制作用;3株菌株代谢产物对人乳腺癌细胞MCF-7、人肺腺癌细胞NCI-H1975和人结肠癌细胞HT-29的生长也有较好的体外抑制效果。结合形态学观察与分子生物学鉴定结果，将菌株ZC-J8鉴定为层出镰刀菌Fusariumproliferatum,菌株BC-J4鉴定为博宁炭疽菌Colletotrichumboninense,菌株BC-G1鉴定菜豆壳球孢Macrophominaphaseolina。对3株活性菌株代谢产物经过LC-MS检测分析显示，代谢产物中含有机酸类及其衍生物、氨基酸类和肽类、生物碱类及其衍生物、糖类、酚类、黄酮类、木脂素和新木脂素类、醌类、核苷类、萜类、香豆素类、脂肪酸类、嘌呤及其衍生物、嘧啶及其衍生物、酚酸类等多种成分。 二、4株活性内生真菌代谢产物的分离鉴定及活性测试 对筛选得到的3株具有抗肿瘤活性菌株以及1株课题前期筛选得到的具有抗菌活性菌株BP-Y6,通过大量发酵获得其代谢产物，利用MCI柱层析，SephadexLH-20凝胶柱层析以及正相硅胶柱层析，再结合半制备液相色谱等分离技术对所得代谢产物进行分离，所得单体化合物利用核磁共振、质谱等技术鉴定其结构,总共鉴定出22个化合物。从菌株BC-J4代谢产物中分离得到8个化合物，分别鉴定为:环（4-羟基脯氨酸-亮氨酸）（1）、尿嘧啶（2）、环（丙氨酸-酪氨酸）（3）、对氨基苯乙酸（4）、曲霉毒素A（5）、2-（4-羟基苯）乙醇醋酸酯（6）、2-（4-羟基苯）乙醇（7）、环（脯氨酸-苏氨酸）（8）;从菌株BC-G1代谢产物中分离得到5个化合物，分别鉴定为:环（脯氨酸-缬氨酸）（9）、4,5,8-三羟基-3-甲基异色原酮（10）、环（苯丙氨酸-丙氨酸）（11）、4-羟基蜂蜜曲菌素（12）、环（苯丙氨酸-酪氨酸）（13）;从菌株ZC-J8代谢产物中分离得到5个化合物，分别鉴定为环（4-羟基脯氨酸-亮氨酸）（1）、环（脯氨酸-缬氨酸）（9）、环（苯丙氨酸-丙氨酸）（11）、环（脯氨酸-色氨酸）（14）、环（脯氨酸-苯丙氨酸）（15）;从菌株BP-Y6代谢产物中分离得到8个化合物，分别鉴定为:尿嘧啶（2）、甲羟戊酸内酯（16）、胸腺嘧啶脱氧核苷（17）、5-羟甲基糠醛（18）、5-羟基己酸-4-内酯（19）、原儿茶酸（20）、N-（2-羟基丙酰基）-2-氨基苯甲酸酰胺（21）和对羟基苯乙酸（22）。通过虚拟筛选技术对分离得到的22个化合物与皮表生长因子受体（EGFR）进行分子对接，结果表明化合物3和14的对接结合能低于EGFR抑制剂厄洛替尼（erlotinib）,推测化合物3和14可能具有抑制肿瘤细胞生长活性。测试了部分分离所得化合物对HepG2细胞和DU-145细胞增殖的作用效果，结果表明化合物3对DU-145的细胞增殖有抑制作用，与分子对接结果相符，首次发现环（丙氨酸-酪氨酸）具有体外抗肿瘤活性，可能通过作用于EGFR靶点发挥作用。 三、紫苏内生真菌产胞外多糖分析及抗氧化活性研究 内生真菌胞外多糖是内生真菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外渗于培养基中的一类糖类化合物，胞外多糖与真菌的环境适应性有关，并具有抗菌、抗氧化等生物活性。对紫苏中分离得到的20株对重金属耐受性强的菌株进行产胞外多糖筛选，通过观察菌落周围有粘稠分泌物为标准初步筛选得到10株可能产胞外多糖菌株，ITS序列比对结果显示，有8株菌株属于Colletotrichum属。对10株菌株通过小量发酵，醇沉得到粗多糖样品;通过苯酚-硫酸法检测样品中多糖含量，有3株菌株BP-J2、ZC-G2和ZC-G4胞外多糖产量明显高于其他菌株，分别为（0.968±0.006）mg·mL-1、（0.804±0.067）mg·mL-1和（0.702±0.028）mg·mL-1。结合形态学观察和分子生物学鉴定，将菌株BP-J2鉴定为胶胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides,菌株ZC-G2和ZC-G4均被鉴定为暹罗炭疽菌Colletotrichumsiamens。粗多糖的抗氧化活性测试结果显示，10株菌株所产粗多糖均对羟基自由基表现出一定的清除作用。 本文对从药食两用植物紫苏中分离得到的对重金属耐受性强的内生真菌进一步筛选得到具有抗肿瘤活性的3株菌株ZP-J8、BC-J4和BC-G1。对3株抗肿瘤活性菌株以及前期获得的1株抗菌活性菌株BP-Y6进行代谢产物分离鉴定，总共得到22个化合物，通过分子对接及体外细胞试验对分离所得化合物抗肿瘤活性进行了筛选和考察。并筛选出3株胞外多糖产量较高的菌株。研究结果丰富了紫苏内生真菌的化学多样性，为解析植物内生真菌与宿主的互作机制，进一步开发利用紫苏功能内生真菌提供物质基础参考。
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