摘要
背景和目的 军团菌在自然环境中普遍存在，主要存在于淡水和潮湿的土壤中，也可以在人工水体中生存。随着中央空调等人工水体的使用，我们日常生活中接触到军团菌的可能性大大增加。军团菌感染引起的军团菌病一般表现为非典型肺炎，通过临床症状、影像学检查等手段很难将军团菌肺炎(Legionnairespneumonia,LP)与其他病原体引起的肺炎进行辨别。因此，及时确定军团菌病原体对LP的确诊和治疗尤为重要。常规的军团菌分离培养法步骤复杂，并且军团菌极难培养，而军团菌尿抗原检测法只能检测特定血清型的嗜肺军团菌，适用检测范围小。PCR、实时PCR等分子生物学检测方法的成本高、耗时长，对检测环境和检测人员要求严格，限制了此类方法的大规模应用。 因此我们拟建立一种更简单、快速的方法——环介导等温扩增法(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)来检测军团菌。它利用两到三对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下进行扩增反应，反应时间仅需30～60分钟。将LAMP反应体系与我们配制的核酸快速释放剂结合，即可适用于即时检验(Point-of-CareTesting,POCT)。该LAMP检测方法有望达到快速、可视化检测军团菌的目的，可作为临床军团菌检测方法的有效补充，完善现有的军团菌实验室检测体系。 方法 1.设计LAMP引物:从NCBI数据库下载军团菌16SrRNA的FASTA文件，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorerV5针对靶基因的6个区域设计两对扩增引物，其中包括一对内引物(FIP/BIP)和一对外引物(F3/B3)。在原有扩增引物基础上，再设计一对用于加速LAMP反应的环引物(LF/LB)。最后再用Primer-BLAST验证引物的特异性。 2.建立LAMP反应体系:通过查阅文献等，初步建立LAMP反应体系，用1％琼脂糖凝胶电泳来验证LAMP反应结果。 3.优化LAMP反应体系:设置一系列的梯度变量，优化LAMP反应体系中的引物浓度、dNTPs浓度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度、反应温度和反应时间。观察LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳结果，并使用ImageJ软件测量各电泳条带的灰度值，确定最合适的LAMP反应参数。 4.建立可视化军团菌LAMP检测体系:在优化后的LAMP反应体系中引入钙黄绿素和Mn2+,在365nm的紫外灯下观察LAMP反应的荧光效果，确定最合适的钙黄绿素和Mn2+浓度。 5.分析可视化军团菌LAMP快速检测体系的敏感性:分别以梯度稀释的军团菌基因组DNA和对数期军团菌作为模板，在365nm紫外灯下观察LAMP反应的荧光效果，并在480nm激发光下检测LAMP反应的荧光强度，确定LAMP反应检测军团菌的敏感性。同时与qRT-PCR法检测军团菌的敏感性作对比。 6.分析可视化军团菌LAMP快速检测体系的特异性:以肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.p)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii,AB)、变形杆菌(Proteus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)、白色念珠菌(Candidaalbicans,C.a)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.a)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.a)等病原体作为对照菌株，以军团菌作为阳性对照，用核酸快速释放剂处理上述病原体使其释放DNA作为检测模板，在365nm紫外灯下观察LAMP反应的荧光效果，并在480nm激发光下检测LAMP反应的荧光强度，确定LAMP反应检测军团菌的特异性。同时与qRT-PCR法检测军团菌的特异性作对比。 7.可视化军团菌LAMP快速检测体系的应用:采集环境水样，在热处理后将其接种于GPCV选择培养基，尝试对环境中的军团菌进行分离培养。同时用核酸快速释放剂处理环境水样，分别用LAMP和qRT-PCR法检测环境水样中军团菌的存在。 8.每项实验都设置三个平行组，对ImageJ软件测量的琼脂糖凝胶电泳条带灰度值和480nm激发光下测得的LAMP荧光强度值进行归一化处理，数据以平均值±标准差表示。采用配对t检验分析实验组与对照组之间的统计学差异，P＜0.05被认为有统计学意义，并使用GraphPadPrism8进行统计绘图。 结果 1.通过Primer-BLAST从设计的多组LAMP引物中筛选出最合适的一组引物，其外引物（F3/B3）BLAST结果显示，除嗜肺军团菌外，该引物还能扩增长滩军团菌、红色军团菌、杜氏军团菌等其他的军团菌属细菌，对军团菌属细菌具有良好的特异性。 2.最佳的LAMP反应条件分别为:0.2μM外引物，0.8μM内引物，0.3μM环引物，1.4mMdNTPs，0.4M甜菜碱，4mMMgSO4,58℃,35分钟。 3.建立的可视化军团菌LAMP检测体系为:1×ThermoPolBuffer(pH8.8,包括20mMTris-HCl,10mMKCl,10mM(NH4)SO4,2mMMgSO4,0.1％TritonⅩ-100),8mMMgSO4,320U/mLBstDNA聚合酶，0.2μM外引物，0.8μM内引物，0.3μM环引物，1.4mMdNTPs，0.4M甜菜碱，25μM钙黄绿素，700μMMn2+,60℃,60分钟。 4.检测梯度稀释的DNA模板结果显示，可视化LAMP检测体系能检测到的最低DNA含量为0.1ng,最少菌落数为0.92CFU（约为1CFU）。qRT-PCR法能检测到的最低DNA含量为0.05ng。该LAMP法检测军团菌的敏感性略低于qRT-PCR法。 5.特异性检测结果显示，对照菌株的LAMP和qRT-PCR检测结果均为阴性。该LAMP方法具有较高的特异性，且能与qRT-PCR法达到同一特异性水平。 6.LAMP法检出环境样本中有军团菌的存在，但培养法并没有观察到军团菌菌落。 结论 成功建立了具有较高的敏感性和良好的特异性的可视化军团菌LAMP快速检测体系。该方法实现了病原体核酸的快速释放、快速检测，反应结果通过肉眼即可辨别，方便快捷且成本低，适合现场检测和即时检验。
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