摘要
背景与目的 IgA肾病(IgAnephropathy,IgAN)是最常见的原发性肾小球疾病，也是导致终末期肾脏病最常见的原因之一。“四重打击学说”是目前被广泛接受和证实的IgA肾病的发病机制假说，外周血B淋巴细胞在其中发挥了至关重要的作用，其分泌的糖基化异常IgA1(Galactose-deficientIgA1,Gd-IgA1)是触发IgA肾病发病的“扳机”，也是四重打击学说的第一重“打击”。IgA肾病患者循环中的浆细胞、记忆B细胞和激活状态的B细胞相对于正常对照的占比显著升高，且与疾病严重程度呈正相关，提示IgA肾病患者循环B细胞生存-死亡失衡。 铁死亡是一种铁依赖性程序性细胞死亡模式，发生机制复杂，既往研究表明，在狼疮性肾炎以及血液系统肿瘤中，铁死亡对B细胞的成熟与生长至关重要，但其潜在机制尚不明确。我们在IgA肾病和正常对照外周血CD19+B细胞中进行蛋白质谱分析，筛选出整合素亚单位β3(Integrinsubunitbeta-3,ITGB3)。在鼻咽癌中，ITGB3可通过调控Nrf2抑制铁死亡。另有研究表明，Nrf2能够有效调控HO-1/NQO-1的表达，从而在铁死亡中发挥关键的作用。基于此，本研究主要证明了ITGB3通过激活Nrf2/HO-1/NQO-1调控B细胞铁死亡参与IgA肾病发病的机制，从而为IgA肾病的诊疗提供新的线索。 方法 (1)利用GEO公共数据库(GeneExpressionOmnibusdatabase，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)的数据集GSE154046,筛选IgA肾病患者与正常健康对照外周血单个核细胞（PBMC）差异基因，并利用铁死亡公共数据库（FerrDbv2），筛选共享差异基因，并进行GO富集分析以及KEGG富集分析。 （2）利用免疫磁珠方法提取IgA肾病和正常对照外周血CD19+B细胞，并提取B细胞蛋白进行蛋白质谱分析，筛选出差异蛋白ITGB3,并利用细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激人永生化B细胞系DAKIKI细胞，WesternBlot检测ITGB3表达，电镜观察细胞线粒体形态改变，确认DAKIKI细胞出现铁死亡表现。 （3）通过敲低与过表达ITGB3两方面研究ITGB3对人源B细胞DAKIKI铁死亡的调控作用。通过使用ITGB3siRNA对DAKIKI细胞进行ITGB3基因敲低，用ITGB3过表达慢病毒对DAKIKI细胞进行ITGB3基因过表达，构建ITGB3敲低的瞬转及过表达的稳转DAKIKI细胞系，并在过表达细胞系中加入铁死亡激活剂Erastin共处理48小时后，收集细胞上清及DAKIKI细胞。通过qRT-PCR、WesternBlot、CCK-8、EDU、ROS、TUNEL及DAPI染色等实验方法检测ITGB3对DAKIKI细胞铁死亡的影响，并通过ELISA检测细胞上清IgA1含量。 （4）通过敲低与过表达ITGB3两方面研究ITGB3调控铁死亡的可能通路。通过使用ITGB3siRNA和慢病毒构建ITGB3敲低的瞬转及过表达的稳转DAKIKI细胞系，并在过表达细胞系中加入铁死亡激活剂Erastin共处理48小时后，收集细胞。通过qRT-PCR、WesternBlot实验方法检测下游通路蛋白Nrf2、HO-1、NQO-1的表达。通过使用Nrf2抑制剂ML385干扰Nrf2表达，收集细胞并检测Nrf2、HO-1、NQO-1以及铁死亡相关指标GPX4、GSH、MDA的表达。 结果 （1）通过GSE154046数据分析，铁死亡基因在IgA肾病患者外周血PBMC中显著富集。随后，通过对两组IgA肾病患者和正常对照的外周血B细胞蛋白芯片进行分析，筛选出与铁死亡相关的目的蛋白ITGB3,并在DAKIKI细胞系中验证了铁死亡存在及受抑制现象。 （2）ITGB3敲低的细胞中，铁死亡被激活，丙二醛（MDA）含量显著升高，抗氧化剂指标的检测显示GSH、GPX4的表达显著降低，ROS生成明显增多，CCK-8、EDU实验表明细胞活力及增殖能力降低，TUNEL实验结果证明细胞死亡有所增加，细胞上清IgA1含量明显减少。 （3）ITGB3过表达细胞中，铁死亡被抑制，丙二醛（MDA）含量降低，抗氧化剂指标的检测显示GSH、GPX4的表达显著增加，同时荧光显微镜观察可见ROS生成明显减少，CCK-8、EDU实验表明细胞活力及增殖能力增加，TUNEL实验结果证明细胞死亡有所减少，细胞上清IgA1含量明显升高，加入铁死亡激活剂Erastin后可以逆转这些现象。 （4）通过qRT-PCR以及WesternBlot实验方法检测Nrf2/HO-1/NQO-1通路蛋白的表达变化。结果表明在ITGB3敲低的细胞中，以上通路蛋白的表达明显降低;而在ITGB3过表达的细胞中，Nrf2/HO-1/NQO-1通路被激活，蛋白表达增加。在加入Nrf2抑制剂后，HO-1、NQO-1的表达显著降低，GSH、GPX4的表达显著降低，而MDA的表达增加。 结论 （1）IgA肾病患者外周血B细胞存在增殖-死亡失衡，B细胞存在铁死亡抑制。 （2）ITGB3在IgA肾病外周血B细胞中高表达，并可抑制铁死亡。 （3）ITGB3通过调控Nrf2/HO-1/NOO-1通路抑制外周血B细胞铁死亡，从而参与IgA肾病发病。
NETL