摘要
目的:RNAm6A修饰在RNA转录进程中发挥关键作用，其在大脑中丰富度明显高于其他器官组织。近年来，研究发现m6A在神经系统发育、损伤修复及多巴胺神经元分化等方面发挥重要的作用，并与神经退行性疾病发生发展密切相关。而m6A及其相关调节因子在帕金森病(PD)发病中的作用尚不清楚。因此，本研究初步探讨m6A及其相关调节因子在PD中的作用及相关机制。 方法:本研究分两部分:①研究对象数据采集:收集原发性PD患者(n=86)和健康对照者(n=86)的血液标本及年龄、性别、药物使用等相关临床基础资料。对PD患者进行HoehnandYahr(H&Y)分期、统一帕金森病分级量表第三部分(UPDRS-Ⅲ)、非运动症状量表(NMSS)以及简易精神状态检查(MMSE)等相关临床量表评分。EpiQuikm6A甲基化定量方法检测外周血单个核细胞(PBMCs)中的RNAm6A修饰水平;RT-qPCR检测m6A甲基转移酶(METTL3、METTL14、WTAP)、去甲基化转移酶(FTO、ALKBH5)及阅读蛋白(YDHTF1、YDHTF2、YDHTF3)的转录水平，ELISA方法检测血浆中α-突触核蛋白(α-syn)水平，分析m6A及其相关调节因子是否有望成为PD早期诊断的新型标志物。②机制研究部分:在SN4741小鼠多巴胺神经元细胞中，利用慢病毒过表达和siRNA干扰技术，根据临床分析结果，进一步通过RT-qPCR和Westernblot实验验证METTL14对α-syn表达的调控作用;通过细胞免疫荧光实验和蛋白免疫印迹实验证实METTL14通过自噬调控α-syn表达;利用Merip-qPCR和双荧光素酶实验证实METTL14对转录因子TFEB的m6A修饰作用。 结果:（1）PD组PBMC中m6A修饰水平与健康对照组相比明显下降（0.062±0.0032vs0.092±0.055,p＜0.01）;（2）其中PD组m6A调节因子METTL3、METTL14及YDHTF2的mRNA水平明显低于健康对照组（均p＜0.01）,而PD组WTAP、FTO、ALKBH5及YDHTF1、YDHTF3转录水平相较于健康对照组均差异无统计学意义。（3）PD组血浆中α-syn水平较对照组显著升高（46.79±12.04vs24.90±12.02,p＜0.01）;进一步相关分析显示:PBMC中RNAm6A修饰水平、METTL3、METTL14以及YDHTF2转录水平与α-syn水平均呈中到低度负相关。（4）根据ROC曲线分析，PBMC中RNAm6A修饰水平以及血浆中α-syn、METTL3、METTL14、YDHTF2水平在一定程度上有助于鉴别PD与健康对照者，而METTL14的敏感性及特异性最高（84.9％，86.1％）,ROC曲线下面积（AUC）为0.915;当METTL14联合血浆中α-syn水平后，其诊断效能进一步增加，达到0.962,其敏感性及特异性较单一α-syn或METTL14时明显增高。（5）在过表达α-syn的SN4741细胞中，沉默Mettl14后α-syn的表达水平明显增加，而过表达Mett114处理则显著减少。（6）沉默Mettl14后自噬水平明显下降，而过表达Mettl14则显著升高，提示Mettl14可能通过自噬途经调节α-syn的表达。（7）在稳定表达Mettl14的SN4741细胞中通过qPCR和westernblot分析常见于PD相关自噬基因的mRNA水平发现过表达Mettl14后自噬转录因子Tfeb水平显著升高（8）沉默Tfeb能明显降低过表达Mettl14对α-syn的抑制作用，说明Mettl14可能通过TFEB调节α-syn的表达。（9）Merip-qPCR和双荧光素实验证实Mettl14通过对TfebmRNA进行m6A修饰，使Tfeb表达水平上调，从而促进α-syn的自噬降解。 结论:（1）临床研究显示PD患者m6A和METTL14水平明显下降，有望成为PD早期诊断新型标志物，其中METTL14与α-syn联合有助于提高诊断效能。（2）机制研究表明:METTL14通过对自噬转录因子TFEBmRNA进行m6A修饰，使得TFEB水平上调，增强自噬功能，进而促进α-syn降解。有望为PD的诊治提供新靶点。
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