摘要
研究背景和目的 前列腺癌(prostatecancer,PC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤。在全球范围内，超过1/4的国家中PC是男性癌症死亡的主要原因，严重威胁男性的生命健康。且其起病隐匿，早期诊断非常依赖于PC早筛。客观原因，我国PC患者初诊时多为中晚期，手术已非首选治疗方案。虽然近年来，以多西他赛、阿比特龙、奥拉帕利为代表的新治疗策略对于中晚期PC患者的预后和无进展生存期有一定的收益，但明显的不良反应和相对严格的适应症仍然限制了它们的临床应用。免疫治疗作为一种新兴的治疗策略，具有靶向性更优、副作用更小的治疗特点，临床上已开展的免疫疗法主要包括以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂、过继性细胞免疫疗法、细胞因子疗法等。但由于PC典型冷肿瘤的免疫微环境特点，以上方法均未实现可靠、有效的治疗结果。 肿瘤疫苗是目前免疫治疗的研究热点之一，主要通过激活肿瘤特异性免疫反应，调动免疫系统主动杀伤肿瘤细胞，实现抗肿瘤效果。其存在多种形式，如肽段疫苗、DNA或RNA疫苗，树突状细胞(dendriticcell,DC)疫苗等。发现肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen,TAA)，特别是肿瘤特异性抗原(tumorspecificantigen，TSA)，借此激活以DC为代表的抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，APC),是目前肿瘤疫苗研发的热点，然而即使一些TSA已明确的癌症类型，在结合现有佐剂的情况下仍然无法实现有效的临床应用。Sipuleucel-T作为唯一被美国食品药品监督管理局(foodanddrugadministration,FDA)批准的前列腺癌DC疫苗，通过体外激活从患者体内分离的外周血DC，再回输患者体内进行治疗，然而在缺乏更有效佐剂的情况下，其治疗效果有限。 近年来，锰离子(Mn2+)被证实具有环磷酸鸟苷-磷酸腺苷酸合成酶(cyclicGMP-AMPsynthase,cGAS)-干扰素基因刺激物(stimulatorofinterferongene,STING)(cGAS-STING)通路激动剂的作用，是一种潜在的疫苗佐剂。此外，佐剂的结构是免疫原性生物材料药代动力学和生物分布的决定因素，可以改变激活免疫细胞的功能状态和比例。 因此，综合以上考虑，研究新型、有效的Mn基PC疫苗佐剂来增强免疫原性，激活有效的特异性免疫应答，对于PC疫苗的研发和临床转化具有极其重要的意义。 研究方法 1.采用溶剂-凝胶法(St?ber法)和油包水乳液法制备球形和棒状二氧化硅(silica,SiO2)微纳颗粒，其中通过调变不同的反应参数实现不同尺寸球形和棒状二氧化硅微纳颗粒的合成，并通过扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope,SEM)和粒径电位仪(dynamiclightscattering，DLS)对其形貌和水合粒径等特征进行表征。 2.利用聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)和高锰酸钾(potassiumpermanganate,KMnO4)可进行氧化还原反应，以及碱性溶液对SiO2刻蚀的能力，以球形和棒状SiO2微纳颗粒为硬模板合成球形和棒状中空二氧化锰(hollowmanganesedioxide,HM)微纳颗粒，并通过SEM、透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)、X射线电子能谱(X-rayphotoelectronspectroscopy，XPS)对其形貌，元素组成、分布以及价态等特征进行表征。 3.从小鼠胫骨和股骨中提取骨髓细胞，并用细胞因子诱导其分化为骨髓源性树突状细胞(bonemarrow-deriveddendriticcells,BMDCs)和骨髓源性巨噬细胞(bonemarrow-derivedmacrophages,BMMs)。将合成的球形和棒状HM生物材料与BMDC进行共孵育处理，并用流式分析仪、激光共聚焦扫描显微镜(confocallaserscanningmicroscope,CLSM)、蛋白免疫印迹(westernblot,WB)以及酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassa,Elisa)对Mn基生物材料激活BMDC成熟，诱导BMDC胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)水平增高以及激活STING和炎症通路的能力进行验证。 4.将Mn基生物材料进行小鼠皮下接种，并在48h后收集注射部位1cm3的皮肤和引流淋巴结(draininglymphnodes，dLNs)，进行单细胞悬液制备和流式染色，随后通过流式分析Mn基生物材料对接种部位和dLNs中的先天免疫细胞的调控和激活情况。 5.根据Mn基生物材料对先天免疫细胞的调控和激活结果，从不同尺寸球形和棒状微纳材料中各优选出1种Mn基生物材料，将它们和BMDC共孵育24h，随后收集BMDC细胞用TRIzol提取总RNA进行bulkRNA测序分析，比较优选生物材料对BMDC激活相关基因的不同调控差异。 6.用BCA蛋白定量试剂盒和DLS仪对Mn基生物材料吸附和释放抗原前后表面电位变化情况以及作为完整肿瘤疫苗的稳定性进行验证，并使用小动物荧光成像仪(invivoimagesystem,IVIS)对携带荧光信号的完整肿瘤疫苗在小鼠接种部位以及体内重要器官的荧光信号强度进行时间点成像分析，其中取优选Mn基生物材料组和Mn2+组的dLNs进行体外成像或制备成单细胞悬液后染色进行流式分析。比较不同Mn基生物材料吸附的抗原在接种部位的保留能力以及体内代谢途径，并进一步分析dLNs中不同亚型的DCs对抗原的摄取能力。 7.构建小鼠PC皮下瘤模型(RM-1),使用优选Mn基生物材料疫苗进行接种治疗，期间每2日监测小鼠体重、肿瘤大小，实验终点时将小鼠处死，取脾脏、肿瘤进行流式分析和病理切片分析。验证Mn基生物材料-RM-1裂解液疫苗在激活特异性免疫反应，招募固有免疫细胞以及逆转肿瘤抑制性微环境方面的效果。 研究结果 1.通过调变反应条件，成功合成了3种不同大小的实心SiO2球(sphere-shapedsolidsilicananoparticles,SSS):SSS-small(SSS-S)、SSS-medium(SSS-M)和SSS-large(SSS-L)，水合粒径分别为47±5nm,129±8nm,和375±8nm。成功合成了3种不同长径比(aspectratio,AR)的实心SiO2棒(rod-shapedsolidsilicananoparticles，RSS),结合其长径比分别命名为RSS-AR3,RSS-AR4.5和RSS-AR6。SSS和RSS均形态均一，分散性良好。 2.通过PEI和KMnO4的氧化还原反应以及碳酸钠(sodiumcarbonate,Na2CO3)刻蚀处理，成功合成了3种不同大小的HM球形材料(sphere-shapedHM，SHM)以及3种不同长径比的HM棒状材料(rod-shapedHM,RHM)，其中SHM粒径分别为63±6nm(SHM-63),151±10nm(SHM-151)，409±11nm(SHM-409);RHM长径比未发生改变(RHM-AR3、RHM-AR4.5、RHM-AR6)。合成的材料在TEM下呈现完整的中空结构，且TEM元素图谱和XPS分析，未见Si元素的残留，且重叠的Mn和O元素分布均匀，Mn价态为+4价，证实其MnO2成分。 3.Mn基生物材料和BMDC共孵育后，相比Mn2+组和对照组，可以显著激活BMDC表面成熟标记物CD80和CD86的表达上调，且CD80+CD86+BMDC百分比也显著增加。此外，Mn基生物材料可以激活BMDC胞内ROS水平，特别是SHM-151、SHM-409、RHM-AR4.5和RMH-AR6。更进一步，Mn基生物材料可以激活BMMs的炎症通路，诱导BMMs释放白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)，特别是SHM-409以及RHM-AR6。此外，Mn基生物材料可以激活BMDCs的STING通路并释放干扰素β(interferon-β,IFN-β)，特别是球形Mn基生物材料。 4.通过小鼠体内佐剂免疫调控实验，证实相对较大的SHM-151、SHM-409和所有RHM(尤其是RHM-AR4.5)在触发促炎表型中性粒细胞的流入和APC细胞的迁移方面表现出优越的能力，此外SHM-151、SHM-409以及RHM-AR4.5组接种部位单核细胞百分比明显下降，提示其向单核来源DC转化并迁徙离开的可能。此外dLNs的分析结果证实SHM-151具有显著的免疫增强能力，可以激活多个功能不同的迁移DC(migratoryDC,MigDC)，如1型常规DC(type1conventionalDCs,cDC1)、2型常规DC(type2conventionalDCs,cDC2)和朗格汉斯细胞(langerhanscells,LCs)，以潜在地触发广泛、持久和有效的适应性免疫反应。所有RHM在皮肤dLNs中cDC1的募集和cDC2的激活方面都表现出优异的性能。因此，结合皮肤和dLNs的分析结果，选择SHM中的SHM-151和RHM中的RHM-AR4.5作为优选材料进行进一步验证。 5.优选材料与BMDC共孵育后，对bulkRNA测序结果分析，显示SHM-151和RHM-AR4.5除上调STING通路相关基因之外，也显著上调了与IFN-α/β和IFN-γ反应相关的基因。相比之下，RHM-AR4.5在细胞因子介导的信号通路的上调以及对病毒的炎症反应和细胞反应方面表现出更好的性能。更进一步，与SHM-151处理相比，RHM-AR4.5处理后，与干扰素γ反应、炎症反应和先天免疫反应(包括正向先天免疫调控反应)这几种富集途径相关的基因受到显著且高度的调节。此外，RHM-AR4.5在上调与单核细胞、中性粒细胞、DC、T和B细胞募集相关的趋化因子基因方面表现出更好的能力，并特异性的促进浆细胞样DC(plasmacytoiddendriticcells,pDC)相关基因的表达上调。 6.对负载荧光的完整Mn基生物材料佐剂疫苗，在小鼠皮下接种后进行IVIS成像分析，显示Mn基生物材料疫苗组具有更好的抗原皮下保留能力，且优选的RHM-AR4.5佐剂疫苗组dLNs中荧光信号在接种后3天内相比其他组具有最稳定的保留能力。进一步对dLNs中DC亚型进行分析，发现RHM-AR4.5疫苗组中，MigDC中的荧光信号随时间逐渐增强，且3天内的增幅最高。 7.小鼠皮下RM-1肿瘤模型发现，SHM-151和RHM-AR4.5疫苗组相比Mn2+组具有显著增强的抗肿瘤效果，特别是RHM-AR4.5。流式分析显示优选Mn基生物材料组均具有显著激活的肿瘤特异性杀伤能力的CD8+和CD4+T细胞，其中RHM-AR4.5可以显著刺激效应记忆T细胞(effectivememoryTcell,Tem)的增殖。此外，RHM-AR4.5组诱导显著的CD8+T细胞、自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)、自然杀伤T细胞(naturalkillerTcell,NKT)的肿瘤浸润，同时显著抑制CD4+T细胞，特别是调节性CD4+T细胞(regulatoryTcell,Treg)的肿瘤浸润。病理切片进一步证实优选Mn基生物材料（特别是RHM-AR4.5）的诱导肿瘤凋亡，抑制肿瘤增殖以及招募CD8+T细胞肿瘤浸润的能力。 研究结论 本项研究结果表明，Mn基生物材料的结构在炎性细胞的招募，APC抗原的捕获和多种免疫细胞相互作用过程中具有差异性，这些因素共同影响了适应性免疫细胞的激活和功能。值得注意的是，我们观察到最佳的Mn基生物材料能够促进BMDC分化为pDC，这可能导致Ⅰ型IFN介导的抗肿瘤免疫增强。Mn基生物材料的结构差异最终转化为治疗性疫苗接种方案中的免疫调控差异，从而在小鼠PC皮下瘤模型（RM-1）中实现了显著的抗肿瘤效果。流式分析结果进一步证实了优选的Mn基生物材料佐剂疫苗可以激活特异性免疫反应，并显著逆转PC抑制性免疫微环境。
NETL