摘要
背景:病态窦房结综合征(SickSinusSyndrome,SSS)，简称病窦，是窦房结(Sinusnode,SAN)及其邻近组织病变引起SAN起搏功能和(或)传导功能障碍引发的一种心律失常综合征，是目前临床上难治性心血管疾病之一。SSS包括房性缓慢性心律失常、窦房阻滞、窦性停博、慢-快综合征等类型。通过心电图、床旁心电监护、动态心电图结合临床症状可做出诊断。SSS患者在病程早期通常无明显症状，随着病程进展逐渐出现心悸、胸闷、耐力下降、短暂性头晕、精神错乱、疲劳、心悸、心绞痛、充血性心力衰竭、中风、短暂性脑缺血发作等心脑血液灌注不足的症状，严重者可能发生心源性猝死。从2012年以来美国人群SSS的发病率逐年上升，至2060年美国每年的SSS新发病例将超过17.2万人。永久起搏器植入术目前是SSS最有效的治疗方式，可以有效减轻SSS患者的临床症状，并提高其生活质量。全球50％以上的外科起搏器植入术是因为SSS，然而，仍有很多SSS患者因不符合永久起搏器适应症而无法得到根本的治疗。而且令人遗憾的是，目前没有证据证明永久起搏器可降低死亡率。此外，永久起搏器还有自主反应性不足、电池寿命有限、起搏器囊袋/导线感染、导线断裂、电磁干扰等缺点。目前治疗SSS常用的西药包括以下几种类型:(1)α和或β受体激动剂(如多巴胺、肾上腺素、异丙肾上腺素);(2)毒蕈碱受体抑制剂(如阿托品);(3)腺苷受体拮抗剂(如氨茶碱、多索茶碱)等。但因其可能引发严重的副作用，如诱发恶性心律失常，导致其应用受到限制。 因此寻求安全有效的治疗SSS的药物成为亟待解决的问题。中医药是一座伟大的宝库，大量中医药相关研究证实中药可以从多靶点、多通路治疗SSS，因此具有巨大的挖掘潜力。国医大师刘志明教授从医八十余载，积累了丰富的临床经验，认为SSS中医病机以“阳虚血瘀”为主，并据此总结出治疗SSS的有效原创方—通阳活血颗粒(TYHX)。随后，国医大师刘志明学术传承负责人刘如秀教授带领团队进行了多年的临床及基础研究，发现TYHX在治疗SSS方面具有独特的优势。前期临床研究发现TYHX能明显提高SSS患者心率，改善心悸、晕厥等临床症状。体内及体外实验研究发现TYHX可以改善缺氧/复氧(H/R)后受损窦房结细胞(SANCs)线粒体能量代谢，促进线粒体功能恢复，抑制钙超载和氧化应激损伤。然而TYHX保护SANCs改善窦房结功能的药效学及其具体药理机制尚未明确。因此，本研究在课题组前期研究的基础上进一步采用网络药理学探讨TYHX药物有效成分作用靶点及通路。随后设计临床试验以观察TYHX治疗SSS患者的疗效及安全性;最后根据网络药理学结果设计基础实验观察TYHX通过调控Ca2+通道蛋白改善H/R后受损SANCs内钙稳态的机制研究。本研究包括TYHX网络药理学、临床试验以及基础实验三部分研究。 研究一:通阳活血颗粒治疗SSS网络药理学研究 目的: 采用网络药理学方法分析TYHX治疗SSS的药物有效活性成分、作用靶点及通路。 方法: 首先，使用herb数据库(http://herb.ac.cn/)筛选TYHX的有效活性成分及作用靶点。接着，使用GeneCards数据库、OMIM数据库和DisGeNET数据库获取SSS相关靶点。然后，将TYHX作用靶点和SSS靶点取交集，并绘制韦恩图。随后，将“TYHX-成分-靶点-SSS”关系导入Cytoscape3.9.1软件，构建“TYHX-成分-靶点-SSS”网络图。接着，利用STRING12.0数据库构建PPI网络，再使用cytoscape3.9.1软件进行拓扑分析，筛选出“药物-疾病”核心靶点。最后使用Metascape数据库对“TYHX-SSS-共同靶点”进行GO分析以及KEGG通路富集分析。 结果: (1)筛选去重后共获取TYHX有效成分254个，包含阿魏酸、异阿魏酸、槲皮素、去甲乌药碱、准格尔乌头碱、人参皂苷、白藜芦醇、黄芩素等活性成分。 (2)TYHX治疗SSS可能作用的靶点有ATP2A2、AKT1、EGFR、HSP90AA1、TNF、STAT3、IL1B、JUN、ESR1、PIR3CA、HIF1A、TUBB、CACNA1C、RYR2等。 (3)TYHX可能通过癌症信号通路、神经活性配体受体互作信号通路、钙信号通路、cAMP信号通路等，发挥改善SANCs功能、提高心率的作用。 结论: TYHX可能是通过阿魏酸、异阿魏酸、槲皮素、去甲乌药碱、准格尔乌头碱、人参皂苷、白藜芦醇、黄芩素等活性成分，作用于ATP2A2、AKT1、EGFR、HSP90AA1、TNF、STAT3、IL1B、JUN、ESR1、PIR3CA、HIF1A、TUBB、CACNA1C、RYR2等靶点，通过癌症信号通路、神经活性配体受体互作信号通路、钙信号通路、cAMP信号通路，发挥改善SANCs功能、提高心率的作用。 研究二:通阳活血颗粒基于阳虚血瘀理论治疗SSS患者临床观察研究 目的: 基于国医大师刘志明从心肾论治SSS的学术思想和TYHX网络药理学结果，以阳虚血瘀型SSS患者为研究对象，进一步验证TYHX治疗SSS患者的有效性及安全性。 方法: 本研究纳入142例于2021年9月至2024年3月期间在中国中医科学院广安门医院门诊及病房就诊的阳虚血瘀型SSS患者。采用随机对照的方式分为3组:中药组(TYHX)48例、西药组(多索茶碱)47例、中西医结合组(TYHX+多索茶碱)47例，脱落20例(中药组7例，西药组6例，中西医结合组7例)。最终完成访期122例(中药组41例，西药组41例，中西医结合组40例)。药物干预4周后检查SSS患者动态心电图(holter)、心电图、超声心动图、同型半胱氨酸(Hcy)、N末端B型钠尿肽前体(NT-proBNP)、血尿便常规、生化等指标的变化，以及中医症候、焦虑抑郁、认知功能、躯体化症状等量表积分的变化。 结果: (1)一般资料(人口学数据、检验指标)比较基线一致。疗前、疗后检查3组SSS患者血尿便常规、生化指标，无显著差异，说明TYHX安全性较好。 (2)SSS发病特点:以老年人多见，在18-29、30-49、50-69、70-85岁区间，各年龄段占比分别为4.1％、10.7％、61.5％、12.8％。发病季节以秋冬季多见，春夏秋冬占比分别为19.6％、14.8％、25.4％、40.2％。 (3)总有效率评价:Holter总有效率评价:中药组82.9％、西药组56.1％、中西医结合组87.8％。心电图总有效率评价:中药组85.3％、西药组61.0％、中西医结合组87.5％。中医症候量表总有效率评价:中药组92.7％、西药组56.1％、中西医结合组95％。整体来看，中西医结合组在Holter、心电图及中医症候积分总有效率等方面的疗效优于中药组及西药组。 (4)TYHX能明显提高SSS患者24小时总心率、平均心率、最低心率、最高心率，缩短最长RR间期，改善心率变异性，疗效优于多索茶碱。中药组和中西医结合组组间比较未见明显差异。 (5)TYHX能明显降低SSS患者血清Hcy和NT-proBNP水平，可能具有抑制炎症反应，改善SSS患者心功能的趋势。以上说明中药组及中西医结合组在改善SSS患者心功能方面，疗效明显优于西药组。 (6)TYHX能明显降低SSS患者中医症候总积分、中医症候单症状积分，改善心悸、胸闷、气短乏力、胸部刺痛、面色苍白、畏寒肢冷、头晕耳鸣、口唇紫绀等不适症状(P＜0.05)。以上说明中药组及中西医结合组在改善SSS患者中医症候积分方面优于西药组。 (7)TYHX能明显降低SSS患者抑郁自评量表(PHQ-9)、焦虑自评量表(GAD-7)积分以及躯体功能障碍量表积分，提高简易认知量表(MMSE)积分(P＜0.01)。中药组及中西医结合组疗效优于西药组。以上说明TYHX能有效缓解SSS患者焦虑、抑郁症状，改善躯体障碍症状，提高脑认知功能，改善SSS患者生活质量。 结论: (1)SSS发病以老年人群为主，秋冬季发病较多，说明衰老与寒邪(阳虚)可能是SSS发病的危险因素。 (2)TYHX能有效提高SSS患者24小时总心率、平均心率、最低心率和最高心率，缩短长RR间期持续时间。中药组及中西医结合组疗效优于西药组，中西医结合组疗效最佳。 (3)TYHX能明显降低SSS患者血清Hcy和NT-proBNP水平，可能具有抑制炎症损伤、改善SSS患者心功能的趋势。 (4)TYHX能明显降低SSS患者中医症候积分，缓解SSS患者焦虑、抑郁症状，改善躯体障碍症状，提高脑认知功能，改善SSS患者生活质量，且安全性好。 研究三:通阳活血颗粒通过调控钙通道蛋白改善H/R诱导的兔SANCs内钙稳态失衡 目的: 基于网络药理学验证的靶点、通路以及前期研究基础，我们发现钙通道可能是TYHX治疗SSS的重要通路。为进一步验证TYHX的作用机制。我们以原代分离的乳兔SANCs为研究对象，从分子生物学变化角度阐明TYHX通过调控Ca2+通道蛋白，维持SANCs内钙稳态，从而改善H/R后窦房结功能障碍的机制。 方法: 选择80只新西兰乳兔(出生时间＜24h)，采用单酶解、差速贴壁法提取原代乳兔SANCs制备SANCs模型。将SANCs随机分为6组:对照组(Control组)、H/R组、阿托品组(atropine组)、TYHX低剂量(Low)组、TYHX中剂量(Medium)组、TYHX高剂量(High)组。采用Real-TimePCR检测各组SANCs内钙通道蛋白(SERCA2a/Cav1.3/NCX/RYR2)的mRNA表达水平。采用WesternBlot检测各组SANCs内Ca2+通道蛋白(SERCA2a/Cav1.3/NCX/RYR2)的蛋白表达水平。采用激光共聚焦法检测各组SANCs内Ca2+浓度和钙波、钙释放水平。采用慢病毒载体及转染技术制备siRNA-β-tubulin和Ad-β-tubulin模型。采用随机分组的方法将SANCs分为5组:对照组(Control组)、H/R组、TYHX组、TYHX+β-Tubulin敲减(siRNA-β-tubulin)组和TYHX+β-Tubulin过表达(Ad-β-tubulin)组。再采用激光共聚焦法检测Ad-β-tubulin和siRNA-β-tubulin后各组SANCs内Ca2+浓度和钙波、钙释放水平。 结果: (1)模型制备结果:采用单酶解、差速贴壁法提取原代乳兔SANCs后进行形态学鉴定，SANCs呈现梭形或三角形，再采用H/R法制备乳兔SANCs损伤模型成功。采用慢病毒载体及转染技术制备siRNA-β-tubulin和Ad-β-tubulin模型成功:RT-PCR检测发现Ad-β-tubulin组β-tubulin的mRNA表达水平显著上升(P＜0.001)，si-β-tubulin组β-tubulin的mRNA表达水平显著下降(P＜0.001)。 (2)Ca2+通道蛋白的mRNA表达水平:与Control组相比，乳兔SANCs经H/R处理后，RyR2的mRNA表达水平显著升高，SERCA2a、NCX和Cav1.3的mRNA表达水平显著降低。TYHX低、中、高剂量和阿托品呈浓度依赖性的提高H/R后SANCs中SERCA2a、NCX和Cav1.3的mRNA表达水平(Control＞High＞Medium＞Atropine＞Low＞H/R,P＜0.001);降低RyR2的mRNA表达水平(H/R＞Low＞Atropine＞Medium＞High＞Control,P＜0.001)。 (3)Ca2+通道蛋白的蛋白表达水平:与Control组相比，H/R组Ca2+通道蛋白SERCA2a、NCX和Cav1.3蛋白表达水平显著降低，RYR2的蛋白表达水平显著提高(P＜0.01)。然而，TYHX低、中、高剂量呈浓度依赖性的提高各组受损SANCs内Ca2+通道蛋白SERCA2a、NCX和Cav1.3的蛋白表达水平(Control＞High＞Medium＞Low＞Atropine＞H/R,P＜0.05)，降低RyR2蛋白表达水平(H/R＞Low＞Atropine＞Medium＞High＞Control,P＜0.05)。 (4)Ca2+浓度:我们发现乳兔SANCs经H/R处理后，H/R组SANCs的Ca2+荧光表达水平显著升高(P＜0.001)。然而，TYHX(25、50、100ug/ml)和阿托品(15ug/ml)可以明显降低乳兔SANCs中的Ca2+荧光表达水平(H/R＞Atropine＞Low＞Medium＞High＞Control)(p＜0.05),且治疗效果呈浓度依赖性。随后，我们使用腺病毒载体制备Ad-β-tubulin和siRNA-β-tubulin乳兔SANCs模型。然而，与H/R组相比，被Ad-β-tubulin处理后的乳兔SANCs在TYHX的干预下，进一步增强了TYHX对SANCs的保护作用，Ca2+荧光水平显著降低(H/R＞TYHX+si-β-tubulin＞TYHX＞Ad-β-tubulin＞Control)。然而，被siRNA-β-tubulin处理后的SANCs,即使在TYHX干预后，Ca2+荧光水平仍显著升高，意味着TYHX对乳兔SANCs的保护作用被消除(P＜0.001)。 (5)钙波、钙瞬变:与Control组相比，H/R造模后SANCs内的钙瞬变增强，钙波幅度增高。然而经过TYHX低、中、高剂量和阿托品干预后，SANCs中的钙波、钙瞬变幅度显著降低(P＜0.001)，而且降低幅度呈浓度依赖性。随后，我们使用腺病毒载体，制备Ad-β-tubulin和siRNA-β-tubulin乳兔SANCs模型。我们发现，与H/R相比，Ad-β-tubulin+TYHX组SANCs钙瞬变和钙波幅度显著降低。这说明Ad-β-tubulin进一步增强了TYHX对SANCs的保护作用。然而，siRNA-β-tubulin+TYHX组SANCs钙瞬变和钙波幅度显著升高，意味着TYHX对乳兔SANCs的保护作用被消除(P＜0.001)。 结论: 在H/R诱导乳兔受损SANCs内，Ca2+通道蛋白调控失衡后出现钙超载现象。然而，TYHX可以通过调控Ca2+通道蛋白SERCA2a/NCX/Cav1.3/RYR2，降低Ca2+浓度以及钙波、钙瞬变幅度，维持SANCs内钙稳态，从而保护由H/R诱导的SANCs损伤。然而，在ad-β-tubulin处理后，SANCs内Ca2+浓度、钙波钙瞬变幅度显著降低,这说明ad-β-tubulin进一步增强了TYHX对SANCs钙稳态的调节作用。然而，si-β-tubulin处理SANCs后，TYHX对钙稳态的调节作用被抵消。因此，TYHX可能是通过调节β-tubulin、调控Ca2+通道蛋白，维持SANCs内钙稳态，从而保护由H/R诱导的SANCs损伤。
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