摘要
目的和意义:本研究通过构建奎扎替尼（AC220）耐药的FLT3-ITD+急性髓系白血病（AcuteMyelocyticLeukemia,AML）细胞株MV4-11（MV4-11/AC220），初步探索MV4-11/AC220对奎扎替尼的耐药相关基因，为克服FLT3-ITD+AML对FLT3抑制剂的耐药性提供思路。 方法:1、通过药物浓度梯度法构建奎扎替尼耐药细胞株MV4-11/AC220,使用CCK8法检测奎扎替尼对MV4-11细胞株、耐药细胞株R1和R2的增殖抑制，计算半抑制浓度及耐药指数。 2、使用实时荧光定量PCR法及Westernblot法测定MV4-11及R1、R2细胞株的多药耐药基因（ABCB1）、多药耐药相关基因（ABCC1）和FLT3基因的表达 3、选择耐药指数较高的R1细胞株与MV4-11细胞株进行生物学功能学差异的比较。使用CCK8法检测二者的倍增时间并绘制倍增曲线。使用流式细胞学检测二者的细胞周期分布和细胞凋亡率。 4、使用高通量转录组测序技术检测MV4-11及MV4-11/AC220细胞的基因表达，通过生物信息学方法分析显著差异表达基因所富集的生物学通路和分子学通路，最后通过结合蛋白互作网络（PPI）分析显著差异表达基因和文献调研筛选出可能与奎扎替尼耐药相关基因，并通过实时荧光定量PCR验证它们的表达。 结果:1、耐药细胞株R1和R2的IC50均高于MV4-11细胞株，R1和R2细胞株的耐药指数（resistanceindex,RI）分别为600.13、467.5。 2、相对于MV4-11细胞株，R1及R2细胞株的ABCC1基因和蛋白呈显著高表达（P＜0.05）、p-FLT3蛋白呈显著高表达（P＜0.05）、ABCB1及FLT3基因和蛋白无明显变化。 3、MV4-11及R1的倍增时间分别为26.92±1.46h、22.07±1.48h,流式细胞学结果示:相对于MV4-11细胞株，R1细胞株处于S期及G2/M期的细胞总和显著增多（P＜0.05）、凋亡率显著降低，（P＜0.05）。 4、富集分析分析得到MV4-11/AC220细胞株显著差异表达基因主要富集于钾通道活性、阳离子通道活性等生物学通路和MAPK信号通路、Rap1信号通路等分子学通路。结合PPI分析和文献调研挑选出关键基因JUN、FOS,并通过实时荧光定量PCR验证，相对于MV4-11细胞，MV4-11/AC220细胞显著高表达JUN、FOS基因（P＜0.05）。 结论:1、通过药物浓度梯度法成功构建MV4-11/AC220细胞株，其耐药可能与ABCC1显著高表达及p-FLT3蛋白激活有关。 2、MV4-11/AC220较MV4-11具有更强的增殖能力和自然抗凋亡能力。 3、结合生物信息学方法分析高通路转录测序数据和文献调研以及实时荧光定量PCR验证，得出JUN、FOS可能是MV4-11/AC220细胞株的耐药关键基因。
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