摘要
轮状病毒(Rotavirus,RV),是一种人兽共患病毒，可引起多种幼龄动物和婴幼儿的病毒性腹泻，极大威胁着公共卫生安全和经济发展。猪轮状病毒可感染各年龄段的猪，尤其是仔猪，不仅会引起腹泻、呕吐和脱水，而且会合并其他消化道疾病引起继发感染，造成全球范围内的巨大经济损失。猪轮状病毒(PoRV)的两种结构蛋白VP7和VP8都是PoRV主要的中和抗原，能够产生中和抗体。其中VP7决定病毒的G血清型，VP8作为感染宿主所必需的蛋白，可与细胞表面受体相互作用。疫苗接种是目前控制此病的重要手段，但由于PoRV血清型众多，且各型之间缺乏交叉保护作用，因此仍然是影响全球公共卫生的一大问题，亟需监控与了解PoRV的感染情况，并且建立快速、准确、特异的诊断方法。 本试验对腹泻粪便样品进行了轮状病毒的分离鉴定，同时表达并纯化了PoRV的VP7和VP8蛋白，以此为抗原，建立了可检测PoRV抗体的间接ELISA诊断方法。具体研究结果如下: 1.猪轮状病毒的分离鉴定 本实验从猪场采集腹泻猪的粪便样品，经过处理后接种MA104细胞进行传代，盲传五代之后出现典型病变，成功分离出PoRV毒株，并命名为RVA/Pig-wt/2023-43。间接免疫荧光对分离病毒进行了鉴定，使用猪轮状病毒阳性血清作为一抗，在倒置荧光显微镜中可见特异性绿色荧光。通过TCID50测定病毒滴度为10-5.25/0.1mL并进行了进化树的构建。可知分离株RVA/Pig-wt/2023-43为G4型，与其同源性最高的毒株为HLJ/15/1,同源性为96.17％,与RVA/pig/CHN/SCMS-69/2017/G4P[23]中国株同源性有95.47％,与人源毒株RVA/Human-wt/PHL/TGE13-85/2013/G4P[6]同源性也有95.32％。 2.轮状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 轮状病毒的VP7蛋白在相同血清型中保守，不同血清型中相差较大。为了建立PoRV分型间接ELISA检测方法，本研究实现了PoRVVP7蛋白的可溶性表达，并在后续的实验中将标签去除，得到了纯化的VP7蛋白，以纯化蛋白包被酶标板，对反应的各个条件进行了优化，摸索出VP7抗体间接ELISA方法的最佳条件:蛋白包被浓度为8μg/mL,4℃包被过夜;最佳封闭条件为1％BSA，37℃封闭1.5h;血清最佳稀释度为1∶250,37℃作用1.5h;二抗最佳稀释度为1∶5000,37℃作用45min;底物最佳显色时间为10min。VP8蛋白具有5个中和抗原表位，可以刺激机体产生中和抗体，并且在A群轮状病毒中较为保守，理论上可以检出A群轮状病毒所有基因型的抗体，因此也选择了VP8蛋白建立间接轮状病毒ELISA检测方法。通过包涵体变性复性的方法得到了纯化的VP8蛋白，对反应的各个条件进行了优化，摸索出VP8抗体间接ELISA方法的最佳条件:蛋白包被浓度为0.5μg/mL，4℃包被过夜;最佳封闭条件为1％BSA,37℃封闭2.5h;血清最佳稀释度为1∶200,37℃作用1.5h;二抗最佳稀释度为1∶8000,37℃作用45min;底物最佳显色时间为15min。敏感性和特异性试验表明，这两种方法均有较高的敏感性和特异性，批内和批间重复性试验的变异系数均小于15％,其中针对VP7抗体的ELISA方法小于10％。对来自不同猪场的临床血清进行检测，VP7抗体检出的阳性率为80.21％;VP8抗体检出的阳性率为79.69％,且使用卡方检验得出，二者之间没有显著性差异(p＞0.05)。因此，本试验建立的间接ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性，为PoRV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和流行病学调查提供了两种快速、简便的血清学诊断方法。
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