摘要
赤藓糖醇是一种天然甜味剂，由于具有不会引发龋齿病、人体耐受性高、适用于肥胖病或糖尿病患者食用等优良性能，通常被用于食品和医药行业。作为多种代糖中唯一使用发酵法生产的糖醇，同时也是中国官方唯一认定可作为“零能量”宣称的糖醇，近年来赤藓糖醇的市场需求持续增长。目前赤藓糖醇的生产方式通常是选取性能优秀的解脂耶氏酵母菌株发酵葡萄糖来实现工业转化，但这对于并不是淀粉产区的地区例如中国广东、广西等省份而言，利用蔗糖作为生产赤藓糖醇的原料明显比葡萄糖更具备竞争优势。然而，解脂耶氏酵母由于自身缺乏水解蔗糖的酶而无法天然地分解利用蔗糖。因此，本课题从一株高产赤藓糖醇的工业解脂耶氏酵母菌株出发，利用生物信息学和代谢工程手段对比分析不同来源的蔗糖酶并将它们在工业菌株中实现异源表达并对赤藓糖醇合成及相关代谢途径进行优化，以获得一株能够利用蔗糖为原料高效合成赤藓糖醇的工业生产菌株。研究结果如下： 选取了酿酒酵母、红发夫酵母、米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌等六种菌种来源的蔗糖酶进行蛋白质序列比对分析，分析显示，不同来源之间的蔗糖酶序列相似性较低，但拥有共同的保守序列。通过非同源重组的方式在解脂耶氏酵母中进行了六种蔗糖酶的异源表达，其中米曲霉蔗糖酶aoARA水解蔗糖能力最强，过表达构建的工程菌株SFE-AO-2在12h内将300g/L蔗糖完全水解为等分子量葡萄糖和果糖，50L发酵罐发酵108h后赤藓糖醇产量为187.5g/L，转化率为62.5%。 50L发酵罐的发酵行为数据显示，解脂耶氏酵母以蔗糖作为碳源时副产物主要为甘露糖醇，产量比葡萄糖为碳源的对照组增加了1.7倍。为了降低甘露糖醇的产量，对解脂耶氏酵母中的甘露糖醇合成途径进行了弱化。利用CRISPR/Cas9技术，对甘露糖醇代谢途径的两个相关基因Mdh1、Mdh2进行了敲除。Mdh1基因和Mdh2基因的单敲除导致甘露糖醇产量比对照菌株分别降低了65%和20%，而Mdh1和Mdh2基因共同敲除菌株SFE-AO2-3的甘露糖醇产量比对照菌株降低了90%，赤藓糖醇的产量增加了10.5%，达到208.45g/L，转化率为64.6%。 相比纯品蔗糖而言，甘蔗汁或蔗糖加工过程中的副产物糖蜜是更为廉价的原料选择。课题对工程菌株SFE-AO2-3蔗糖原料发酵生产赤藓糖醇的培养基进行了优化。结果显示甘蔗汁可以完全代替发酵培养基中的碳源和80%的酵母提取物以及金属离子的添加。所得赤藓糖醇产量比以葡萄糖为碳源时增加5%。糖蜜由于含有较高浓度的盐和无机化合物，因此虽所含蔗糖浓度较高（55%），但并不适合用于直接作为碳源发酵生产赤藓糖醇。糖蜜中富含的营养物质有利于菌体生长，也可以代替培养基中的部分营养物质。以葡萄糖为碳源时添加2%的糖蜜能够代替原本培养基中60%的酵母粉，并且不用添加铵盐，所得的赤藓糖醇产量与对照组大致相同。 本论文通过异源表达蔗糖酶构建了一株能够利用蔗糖为碳源高效生产赤藓糖醇的工业菌株，敲除两个甘露糖醇脱氢酶基因降低了副产物甘露糖醇的产量并提高了赤藓糖醇的产量和转化率，开发了以甘蔗汁为碳源、糖蜜为营养物质的廉价原料培养基，这些为赤藓糖醇的工业高效合成提供了新的降低成本方案与优良性能菌株。
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