摘要
背景 胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是常见的原发性肝脏恶性肿瘤，肝内胆管细胞癌(intrahepaticcholangiocarcinoma,ICC)约占CCA的5-10％,其发病率在全球范围内不断增加;在过去40年间，ICC的发病率上升了140％以上。ICC恶性程度高、预后差，手术切除仍是目前根治ICC的唯一有效治疗手段，但因其起病隐匿、早期临床症状不显著，大多病人诊断时即为晚期从而丧失手术机会。因此寻找新的治疗方法意义重大;近些年由于医学研究和技术的飞快发展，ICC的新辅助治疗方面取得一定成果，但其较短的生存期仍是目前ICC治疗所面临的巨大挑战。核糖体蛋白L6(ribosomalproteinL6,RPL6)属于核糖体蛋白的L6E家族，它在多种肿瘤的发生发展中发挥关键作用，然而，关于RPL6在ICC中的作用及其意义尚未明确。 目的 观察RPL6在ICC中的表达，分析RPL6表达与临床特征之间的相关性;探讨RPL6对ICC细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，观察RPL6表达量对ICC细胞周期进程及凋亡的作用，进一步探索RPL6可能影响ICC进展的机制。 方法 1.利用在线生物学信息库geneexpressionprofilinginteractiveanalysis(GEPIA)、theuniversityofalabamaatbirminghamcancerdataanalysisportal(UALCAN)数据库分析RPL6在ICC癌组织和癌旁组织中的表达水平。 2.收集2021年10月至2023年10月就诊于郑州大学人民医院(河南省人民医院)行手术治疗的41例ICC癌组织及其相应的癌旁组织，免疫组织化学技术检测RPL6在ICC组织中的表达，实时荧光定量聚合酶链式反应(real-timequantitativePCR,qRT-PCR)、蛋白质印迹法(westernblot,WB)分别检测RPL6表达水平，结合ICC患者临床信息评估RPL6与临床特征的相关性。 3.小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)转染到ICC细胞系(RBE、HuCCT1)后，分别为实验组(sh1组、sh2组)以及未作处理的空白对照组(NC组)，qRT-PCR、WB分别检测验证实验组、对照组细胞株RPL6的mRNA和蛋白表达情况。 4.细胞增殖分析:平板克隆实验、细胞计数试剂盒(cellcountingkit-8,CCK-8)分别检测实验组和对照组细胞株细胞增殖能力。 5.细胞迁移能力分析:利用细胞划痕愈合实验评估实验组和对照组细胞株细胞的迁移能力。 6.细胞侵袭能力分析:Transwell实验观察细胞穿过小室的数量检测实验组和对照组细胞株细胞侵袭能力。 7.细胞周期及凋亡分析:流式细胞术分别检测细胞凋亡及细胞周期分布情况。 8.最终结果使用SPSS最新版本28.0.1.1分析，分别将实验组与对照组作比较，计量资料以均数±标准差（(x)±s）表示，两组数据间比较采用t检验。计数资料以百分比（n％）表示，采用卡方x2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果 1.GEPIA、UALCAN数据库中显示RPL6在多种肿瘤中表达升高，例如在结肠癌、ICC、弥漫性大B细胞淋巴瘤、甲状腺癌、胸腺癌等肿瘤中表达升高;qRT-PCR、WB结果显示ICC癌组织中达量比癌旁组织高，并且表达量较高的患者预后总生存期较差（P＜0.05）。 2.免疫组织化学实验结果表明RPL6在组织中表达量较癌旁组织中高，且主要分布于细胞核中，部分分布于胞质中（P＜0.05）。 3.qRT-PCR、WB分别检测癌组织及癌旁组织中mRNA及蛋白表达量，结果表明RPL6在癌组织中mRNA、蛋白表达量明显高于癌旁组织（P＜0.05）。 4.利用siRNA构建RBE、HuCCT1细胞株瞬时敲低细胞株sh1、sh2组和空白对照组NC组。qRT-PCR、WB分别检验siRNA转染效果，结果表明实验组mRNA、蛋白表达量明显低于对照组，RPL6敲低成功（P＜0.05）。 5.收集ICC患者临床资料，结合临床特征分析表明RPL6表达与肿瘤大小、有淋巴结转移呈正相关，与肿瘤分化程度呈负相关（P＜0.05）。与患者性别、年龄、有无病毒性肝炎感染、TNM分期无关。 6.细胞增殖实验结果:在CCK-8实验中，敲低RPL6后实验组细胞在450nm细胞光密度值（OD450nm）与对照组相比明显减弱（P＜0.05）;细胞集落形成实验显示实验组细胞集落形成数目明显少于对照组（P＜0.05）。 7.细胞迁移实验结果:细胞划痕愈合实验结果表明敲低后的实验组细胞株24h划痕愈合面积较对照组明显减小（P＜0.05）。 8.细胞侵袭实验结果:在Transwell实验中，实验组细胞穿过小室的数目相较于对照组细胞数目明显减少（P＜0.05）。 9.细胞凋亡、周期实验结果:流式细胞术结果表明敲低RPL6后实验组细胞凋亡率明显高于对照组(P＜0.05);实验组G0/G1期细胞比例明显高于对照组，细胞周期被阻滞于G0/G1期，S期细胞比例明显低于对照组(P＜0.05)。 结论 1.RPL6在肝内胆管细胞癌组织及细胞中表达上调; 2.RPL6与肝内胆管细胞癌肿瘤直径≥5cm、有淋巴结转移呈正相关，与肿瘤分化程度呈负相关; 3.敲低RPL6的表达明显促进肝内胆管细胞癌细胞凋亡，并同时抑制其增殖、迁移和侵袭能力以及细胞周期进程。 4.RPL6可作为一种促癌因子参与肝内胆管细胞癌的进展。
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