摘要
背景:原发性肝癌（Primaryhepaticcarcinoma，PHC）是世界上发病率第六、死亡率第三的癌症，包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌及混合型肝癌，其中HCC是最常见的类型，占PHC的70-85％。目前治疗HCC的主要方法有手术、肝移植、射频消融、经肝动脉化疗栓塞、分子靶向药或免疫治疗等。尽管目前在诊断和治疗方面做了很多努力，但HCC的预后仍不理想。由于HCC发生是一个复杂的过程，涉及一系列遗传或表观遗传改变，最终导致肝细胞恶性转化。因此，研究HCC发生的分子机制和致病机制对于提高人类HCC的诊断和治疗具有重要意义。 众所周知，长链非编码RNA（longnon-codingRNA,LncRNA）是一种不具备蛋白质编码能力的RNA分子，长度超过200nt,其特征是生物学功能和作用机制的多样性和复杂性。LncRNA可作为癌基因或肿瘤抑制因子，调节多种生物学过程，如细胞增殖、抗凋亡、诱导血管生成、促进转移、逃避肿瘤抑制因子等细胞功能。尽管众多的LncRNA及其功能已经被鉴定出来，但只有一小部分在HCC的进展中得到了研究。因此，LncRNA在HCC中的表达模式、生物学作用和功能机制仍需进一步研究。 瞬时受体电位（Transientreceptorpotential,TRP）家族是一个广泛表达的大型离子通道超家族，研究显示TRP通道存在异常多样的功能特性，通过改变钙离子的稳态，并对多种生理和病理状况产生深远影响，如促进增殖、诱导分化和凋亡。例如，TRPV1和TRPV4参与细胞迁移，TRPC6和TRPM7参与细胞增殖。尽管初步探索了TRP通道在HCC中的表达，但关于TRP通道在HCC发生和发展的调节中的作用，特别是对HCC发生和发展的功能性影响的研究仍较少。 本研究以3例Ⅳ期肝癌临床样品的癌旁组织和对应的癌组织为样品，通过高通量测序检测TRP离子通道家族基因在各个样品中的表达量，从中筛选在癌组织中高表达的LncRNATRPC7-AS1作为目标基因，利用生物信息学分析预测TRPC7-AS1在肝癌组织中的表达水平及其富集通路，并从细胞水平验证TRPC7-AS1在肝癌细胞中的表达水平及其对细胞系生物学功能的影响。 第一部分:基于高通量测序及生物信息学分析LncRNATRPC7-AS1在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 目的:通过高通量测序分析肝癌组织及其癌旁组织中TRP通道家族的表达量，从中筛选出目标基因，生物学信息分析探讨HCC中目标基因表达情况，同时寻找目标基因功能富集通路，并分析其与相关通路基因的相关性。 方法:根据高通量测序的结果筛选出目标基因LncRNATRPC7-AS1。基于TCGA数据库通过公共数据库GEPIA网站进行分析，分析TRPC7-AS1在HCC组织及正常组织中的表达情况及其在临床分期中的表达变化。对TRPC7-AS1共表达基因进行功能富集分析，进一步分析TRPC7-AS1与相关通路的关键基因之间的相关性。 结果:1.对3例Ⅳ期肝癌及癌旁组织进行高通量测序，发现TRPC7-AS1、TRPC4AP、PKD1P6、PKD1P1在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，取LncRNATRPC7-AS1为目标基因进行下一步研究。 2.基于TCGA数据库通过公共数据库GEPIA网站进行分析，结果显示TRPC7-AS1在HCC中高表达，但在HCC患者临床病理分期中表达无显著差异。 3.功能富集分析结果发现TRPC7-AS1在Wnt/β-catenin信号通路被显著富集，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在对肝癌干细胞特性的维持具有关键性作用;基于TCGA数据库进一步探究对TRPC7-AS1与干细胞之间的关系，初步研究结果显示在肝癌组织中TRPC7-AS1与干细胞表面标志物CD133、CD90、CD13、EPCAM的表达呈正相关。 结论:1.TRPC7-AS1在肝癌组织显著高于癌旁组织; 2.TRPC7-AS1的共表达功能富集分析显示与Wnt/β-catenin通路有关; 3.TCGA数据显示TRPC7-AS1与干细胞表面标志物CD133、CD90、CD13、EPCAM的表达表现为显著正相关。 第二部分:细胞水平探讨LncRNATRPC7-AS1对HCC细胞生物学行为的影响 目的:探讨LncRNATRPC7-AS1对肝癌细胞增殖、侵袭、细胞凋亡等生物学功能的影响及调控作用，为肝癌疾病的治疗提供新的思路与潜在靶点。 方法:qRT-PCR检测LncRNATRPC7-AS1在肝癌细胞株（HepG2,MHCC97H）及正常肝细胞株HL-7702（LO2）中的表达。在肝癌细胞MHCC97H中转染si-TRPC7-AS1以敲低TRPC7-AS1的表达，CCK8检测细胞增殖能力变化;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力变化;Westernblotting检测不同TRPC7-AS1水平的凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达变化。 结果:1.采用qRT-PCR方法检测肝癌细胞株（HepG2,MHCC97H）及正常肝细胞株LO2中的表达情况，结果显示，TRPC7-AS1在肝癌细胞MHCC97H和HepG2中的表达量明显高于人正常肝细胞LO2。 2.CCK8检测结果显示，与si-NC组相比，MHCC97H中敲低TRPC7-AS1可抑制肝癌细胞的增殖能力。 3.Transwell侵袭实验结果显示:敲低MHCC97H细胞中LncRNATRPC7-AS1的表达后，肝癌细胞的侵袭细胞数量明显减少。 4.WB结果显示，敲低MHCC97H细胞中LncRNATRPC7-AS1的表达能促使凋亡相关蛋白Bax表达升高、Bcl-2表达降低、Bax/Bcl-2的比值升高，这一结果说明TRPC7-AS1可以通过影响细胞凋亡参与肿瘤的发生发展。 结论:敲低肝癌细胞中LncRNATRPC7-AS1的表达可显著降低MHCC97H细胞的增殖能力、侵袭能力，并诱导细胞凋亡。
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