摘要
稀有糖D-阿洛酮糖(D-allulose)的甜味特征与蔗糖相似，具有抗氧化、预防II型糖尿病、降血糖血脂等重要生理功能，当前主要由D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose3-epimase,DAEase)催化D-果糖合成。然而，DAEase较低的热稳定性、最适催化条件偏碱性及催化活性不足限制了其在规模化生产中的应用。基于此，本研究以源于鲍氏梭菌(ClostridiumbolteaeATCCBAA-613)的DAEase为研究目标，结合分子对接、饱和突变等方法对其进行理性设计，得到催化能力增强、工业应用价值提高的突变体。主要研究结果如下： 1.利用脯氨酸效应提升DAEase的热稳定性。应用RosettaCartesian_ddg模块对DAEase进行全蛋白脯氨酸扫描，构建了七个突变体蛋白。其中，Cb-R2P、Cb-V229P的最适温度从55℃提高至65℃，Cb-E6P、Cb-T204P、Cb-G119P的最适温度提高至60℃；Cb-R2P、Cb-E6P在55℃下的半衰期(t1/2)及Tm分别为61.3min、56.3℃和71.2min、57.2℃，高于野生型(52.6min、55.8℃)。模拟分析结果表明脯氨酸效应改造降低了DAEase内局部无规则卷曲位点的能量，增加了结构刚性，这可能是其热稳定性提升的主要原因。 2.基于蛋白表面电荷设计提升DAEase的酸稳定性。应用Rosetta_supercharge对DAEase进行表面电荷设计，构建了四个突变体。其中，Cb-S46D、Cb-K57D及Cb-A83D的最适pH从7.0移至6.5，且在偏酸环境下的残余酶活高于野生型，对其进行表面电荷分析，发现天冬氨酸的引入增加了突变酶表面的负电荷，可能是突变体最适pH偏移的主要原因。 3.通过分子对接及虚拟饱和突变提升DAEase的催化活性。结合DiscoveryStudio及RosettaCartesian_ddg对Cb-DAEase进行精准分子对接及虚拟饱和突变，通过结合能变化筛选预测突变体，构建了十二个突变体。其中，突变体Cb-Q109C、Cb-D137C和Cb-I269Y的酶活分别为野生型的106.7%、115.4%及178.2%。并对I269Y进行模拟结构分析，发现突变后的酪氨酸残基与底物的距离缩短及氢键数量增加，使底物的结合能力增强，从而提升了酶活。 4.对DAEase进行组合突变。对前三章中的有效突变体进行组合突变，构建了六个突变体。其中，两个突变体表现出良好的酶学性质，突变体Cb-R2P-E6P-D137C的酶活性为野生型的155.6%，半衰期提升了15.7min，Tm值提升了1.1℃；突变体Cb-R2P-E6P-A83D-D137C的酶活性为野生型的139.7%，半衰期提升了12.3min，Tm值提升了0.8℃，并且在pH5.0时还保持68%的酶活性。
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