摘要
研究背景 盆腔器官脱垂(pelvicorganprolapse,POP)不同程度地影响患者的心理健康及生活质量。重度POP患者的治疗以手术为主，但术后复发率高。阐明POP的发病机制，从病因的角度为其防治探索新的靶点，可能为解决当前临床困境提供新的思路。 高龄是POP的独立危险因素，而衰老细胞的积累是年龄增长过程中的重要生物特征。研究发现衰老细胞分泌的炎症因子及趋化因子在POP患者的阴道壁组织中表达上调，提示细胞衰老可能参与了POP的发生和发展。氧化应激为细胞衰老的常见诱因。研究发现POP患者盆底支持组织中存在氧化产物的积累以及抗氧化酶表达的下调，提示POP患者存在较高的氧化应激水平。既往有综述提出氧化应激诱导的细胞衰老参与POP的发生，但目前还缺乏更深入的研究。 沉默信息调节因子2相关酶1(silencinginformationregulator2relatedenzyme1,SIRT1)属于一类去乙酰化酶，可以通过调控下游多种靶基因的乙酰化水平，调节多种细胞活动。SIRT1的下调参与了多种年龄相关疾病及退行性病变的发生。然而，SIRT1在POP发生发展中的作用目前尚不清楚。 研究目的 本研究旨在评估SIRT1在POP患者中的表达及与临床特征的相关性，探究SIRT1表达水平对人盆底支持组织中成纤维细胞生物学行为及氧化应激损伤的影响。 研究方法 选取2022年12月至2023年12月于山东大学齐鲁医院妇产科因POP行子宫切除术的患者为病例组，选取同期因非POP的其他疾病行子宫切除术的患者为对照组。收集患者的年龄、月经状态、生产次数、身高及体重等临床信息。术中收集患者的子宫骶韧带(uterosacralligament,USL)组织。 应用免疫组化染色评估USL组织中SIRT1的表达水平。分离提取并体外培养来源于USL组织的人子宫骶韧带成纤维细胞(humanuterosacralligamentfibroblasts,hUSLFs)利用SRT1720(SIRT1激动剂)过表达SIRT1,利用过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)构建体外细胞氧化应激模型。应用CCK-8实验检测细胞增殖，DCFH-DA探针检测细胞活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平，TUNEL染色及β-半乳糖苷酶染色检测细胞凋亡及衰老水平，westernblot及RT-qPCR实验检测相关分子标志物的表达水平。 应用GraphPadPrism8.3.0及SPSS26.0软件进行统计分析。单因素及多因素logistic回归分析用于探究与POP相关的危险因素。非配对t检验、单因素方差分析、Mann-WhitneyU检验及x2检验用于比较组间差异。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。 研究结果 1.SIRT1在USL组织中低表达。研究最终纳入了70名POP患者和15名对照组患者。苏木素-伊红染色结果证明术中获取的组织为韧带组织。免疫组化染色显示SIRT1主要定位于细胞核。统计结果显示POP组USL组织中SIRT1的表达水平显著低于对照组(P＜0.0001),而其平均年龄和绝经率高于对照组。Logistic回归分析结果显示，年龄(OR=1.43,95％CI=1.07-1.90,P=0.0146)和SIRT1表达水平(OR=0.64，95％CI=0.46-0.89,P=0.0076)与POP独立相关。亚组分析结果表明，对照组(n=15)的SIRT1表达水平高于年轻POP组(年龄≤56岁，n=17,P=0.0021),而年轻POP组的SIRT1表达水平高于老年POP组(年龄＞56岁，n=53,P=0.0445)。另外，POP-QⅡ度患者(n=42)的SIRT1表达水平略高于POP-QⅢ-Ⅳ度患者(n=28，P=0.0147)。 2.hUSLFs的鉴定。免疫荧光染色结果显示培养的细胞中96.56±1.88％角蛋白染色阴性，波形蛋白阳性，提示大多数为成纤维细胞。 3.SRT1720可以上调POP组hUSLFs中SIRT1的表达。Westernblot及RT-qPCR结果表明，POP组hUSLFs的SIRT1的表达水平显著低于对照组(P＜0.0001)。应用2μMSRT1720处理POP组hUSLFs可以上调SIRT1表达(P=0.0003)。 4.过表达SIRT1可以改善POP组hUSLFs的生长状态。POP组hUSLFs的ROS水平及细胞衰老比例高于对照组，而细胞增殖能力低于对照组。上调SIRT1表达可以降低POP组hUSLFs的ROS水平，促进细胞增殖(P＜0.05)，并减轻细胞衰老(P＜0.0001)。Westernblot结果显示过表达SIRT1可以上调p-Rb/Rb,下调P21和P16。 5.H2O2可以诱导对照组hUSLFs的氧化应激损伤。应用H2O2构建细胞氧化应激模型，结果显示H2O2可以下调非POP患者hUSLFs的SIRT1表达，提高细胞ROS水平，并以浓度和时间依赖模式抑制细胞增殖。另外，随着H2O2浓度的升高，细胞凋亡和衰老的比例增加。Westernblot结果显示，H2O2处理可以诱导Caspase3和PARP裂解，上调Bax,P21及P16,下调Bcl-2及p-Rb/Rb。 6.SRT1720预处理可以预防H2O2诱导的对照组hUSLFs的氧化应激损伤。与单独应用H2O2处理的细胞相比，SRT1720预处理可以上调SIRT1表达，降低细胞ROS水平，减轻H2O2诱导的细胞增殖的抑制(P＜0.05),细胞凋亡(P＜0.0001)和衰老(P＜0.0001)。SRT1720预处理可以降低H2O2诱导的凋亡和衰老相关标志物表达水平的变化。 研究结论 SIRT1在POP患者的USL组织及成纤维细胞中低表达，过表达SIRT1可以改善来源于POP患者的hUSLFs的生长状态，预防H2O2所诱导的来源于非POP患者的hUSLFs的氧化应激相关损伤，提示SIRT1有望成为POP的治疗和预防靶点。
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