摘要
水牛是世界第二大产奶家畜，具有耐粗饲、抗逆性好等特点，被国际粮农组织（FAO）认为是最具开发价值的家畜之一。腹泻影响犊牛正常生长发育，严重降低养殖企业经济效益。细菌感染是犊牛腹泻的主要病因，其中沙门菌（Salmonella）作为重要病原菌，可引起犊牛严重腹泻、败血症甚至死亡。临床上，常用抗生素治疗沙门菌感染，但随着细菌耐药和药物残留等问题的不断威胁，科学家们开始关注具有杀菌能力强、安全性高和成本低廉等优势的噬菌体产品。然而，目前沙门菌噬菌体裂解机制的相关研究较少，阻碍了沙门菌噬菌体的临床利用。 本研究通过调查广西腹泻水牛犊沙门菌的流行病学和耐药现状，利用转录组学探究噬菌体与沙门菌的相互作用机制，并评估分离噬菌体对小鼠沙门菌结肠炎的治疗效果，为噬菌体临床应用和沙门菌有效防治提供理论依据。研究内容及结果如下： （1）腹泻水牛犊沙门菌的分离纯化及生物学特性分析 采集178份腹泻水牛犊粪便，通过形态学观察、生化试验和毒力基因检测发现42株沙门菌。通过特异性毒力基因分型鉴定获得13株Salmonellaenteritidis，4株Salmonellatyphimurium和9株Salmonelladublin。通过抗生素敏感性试验、大蜡螟幼虫毒力试验和全基因组测序，最终筛选得到1株对β-内酰胺类、四环素类和氨基糖苷类抗生素耐药，且包含132个毒力基因和34个耐药基因的高毒力肠炎沙门菌，命名为G33T-2。 （2）沙门菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究 以G33T-2为宿主菌，利用双层琼脂平板法发现4株裂解性噬菌体：NM-2-1、NM-2-3、NM-3和NM-4。通过宿主谱检测、温度和pH稳定性试验，发现4株噬菌体在40~60℃、pH3~10条件下均保持良好活性。NM-2-1、NM-2-3和NM-3均能够裂解17株沙门菌、1株大肠杆菌、1株多杀性巴氏杆菌和1株溶血性曼氏杆菌。NM-4为高度特异性的RNA噬菌体。一步生长曲线显示：NM-2-1潜伏期约为5min，裂解量约为69PFU/cell；NM-2-3潜伏期约为10min，裂解量约为142PFU/cell；NM-3潜伏期约为10min，裂解量约为197PFU/cell；噬菌体NM-4潜伏期约为5min，裂解量约为106PFU/cell。通过透射电镜观察和全基因组测序显示：NM-2-1、NM-2-3和NM-3均为Caudoviricetes科，且NM-2-1、NM-2-3和NM-3全基因组未发现毒力基因、溶源基因和耐药基因。 （3）转录组学探究噬菌体裂解沙门菌的机制 以NM-3为研究对象，不同时期提取NM-3与沙门菌共培养物的总RNA，进行转录组学测序分析。通过GO和KEGG分析，发现感染早期，NM-3主要影响沙门菌核苷酸和蛋白质的合成与代谢；感染中期，NM-3主要参与沙门菌生物合成与代谢；感染后期，NM-3可能激活沙门菌限制性修饰（R-M）系统和毒素-抗毒素（T-A）系统。NM-3感染前后，沙门菌80.30%的毒力基因和36.36%的耐药基因发生显著变化（P＜0.05）。通过构建噬菌体与沙门菌基因共表达网络，在不同时期筛选到9个主要参与沙门菌核糖体和转运蛋白相关通路的噬菌体关键基因。 （4）噬菌体对沙门菌结肠炎小鼠的治疗效果研究 在成功构建小鼠沙门菌结肠炎模型的基础上，探究利用NM-3治疗沙门菌结肠炎小鼠的治疗效果。与模型组相比，NM-3组可显著提高小鼠存活率（Plt;0.05）。NM-3组脾脏、结肠、肝脏和肺脏炎性细胞浸润显著减少，有效治疗结肠上皮细胞脱落、肌层断裂和隐窝排列不齐。NM-3治疗后脾脏、肺脏、肝脏器官指数和载菌量均出现显著降低（Plt;0.05），结肠炎性因子IL-1β、IL-10和TNF-α的基因表达量显著降低（Plt;0.05），紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的基因表达量极显著升高（Plt;0.05）。通过肠道菌群检测，显示NM-3组小鼠肠道菌群结构与PBS组更接近，菌群丰度明显高于抗生素组。 综上所述，结论如下： （1）广西水牛场存在沙门菌性犊牛腹泻，以及多重耐药现象。 （2）分离的4株裂解性噬菌体生物学特性良好。 （3）噬菌体NM-3感染沙门菌后可影响沙门菌耐药和毒力基因表达。 （4）噬菌体NM-3能够有效治疗小鼠沙门菌结肠炎。
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