摘要
目的和意义: 随着对肿瘤生物学复杂性的认识加深，代谢重编程已成为肿瘤恶性进展的标志。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associatedfibroblasts,CAFs）不仅可以直接或间接分泌可溶性细胞因子作用于肿瘤细胞，还可以作为主要调节因子参与塑造肿瘤代谢重编程，在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。尽管关于CAFs与肿瘤细胞代谢重编程的相互作用开始引起人们的关注，但CAFs在肿瘤代谢重编程中发挥的作用及其潜在的机制尚不清楚。本研究基于蛋白质组学和代谢组学技术系统全面的探讨CAFs促进肝癌进展的蛋白质表达谱和代谢物谱，筛出关键差异蛋白质及代谢物并挖掘潜在作用机制，旨在从代谢角度探讨CAFs的促癌新机制，为抗肝癌提供新的思路和理论依据。 方法: 本课题采用正常成纤维细胞（normalfibroblasts,NFs）和CAFs来源的条件培养基（conditionedmedium,CM）与肝癌细胞进行共培养，首先通过CCK8、平板克隆、transwell迁移和侵袭、细胞周期等实验观察NFs和CAFs对肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭及细胞周期等生物学行为的影响。然后采用label-free蛋白质组学和广泛靶向代谢组学方法，深入挖掘NFs和CAFs来源CM诱导肝癌Huh7细胞的差异表达蛋白谱和差异代谢物谱，并采用生物信息学方法对差异表达蛋白和差异代谢物进行GO、KOG、PPI及KEGG富集分析寻找可能的分子通路。进一步采用qRT-PCR和westernblot技术验证了关键差异表达蛋白的mRNA表达水平及β-catenin和Ras蛋白信号通路关键分子的表达。最后，为了研究CAFs调节肿瘤细胞代谢稳态，利用氨基酸检测试剂盒检测NFs和CAFs来源CM及肿瘤间质液中的氨基酸含量;采用支链氨基酸（branchedchainaminoacid，BCAA）和谷氨酰胺（glutamine,Gln）剥夺实验来验证氨基酸代谢对NFs和CAFs诱导肝癌细胞增殖、克隆形成、侵袭和细胞周期进展的恶性细胞表型以及分子机制的影响。 结果: 细胞功能实验结果显示，与NFs-CM处理组相比，CAFs-CM处理的肝癌Huh7和HCC-LM3细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力显著增强。细胞周期结果显示，CAFs-CM处理后肝癌Huh7和HCC-LM3细胞处于G1期的细胞比例均低于NFs-CM处理组，而S期及G2期细胞所占比例明显高于NFs-CM处理组。qRT-PCR实验结果发现CAFs-CM处理的肝癌Huh7和HCC-LM3细胞中cyclinD1和cyclinE1的mRNA表达水平明显高于NFs-CM处理组。 采用label-free蛋白质组学技术分析CAFs和NFs来源CM处理肝癌Huh7细胞的蛋白表达谱并按照差异倍数＞1.5或＜0.67标准筛选差异表达蛋白，共筛选出39个差异表达蛋白，其中有30个差异表达蛋白在CAFs-CM处理的肝癌Huh7细胞中表达上调，9个差异表达蛋白在CAFs-CM处理组表达下调。亚细胞定位分析显示50％的差异表达蛋白定位于细胞质，属于分泌型蛋白。GO富集分析表明，CAFs-CM处理组和NFs-CM处理组对比差异表达蛋白多富集于胞内多囊体、高尔基体、内小体等细胞质区域;分子功能主要体现在酶活性和结合活性;主要参与Ras蛋白信号转导、细胞周期调控、小GTP酶介导的信号转导等生物学过程。KOG与PPI分析也发现差异表达蛋白与细胞周期调控相关。qRT-PCR实验验证了13个差异表达蛋白包括GOSR1、CHMP7、FBXO6、SPC24、IQGAP3、SH3GLB1、TRIP13、TAX1BP3、ANAPC7、PSMG2、AHCTF1、CTNNAL1、LAMTOR5的mRNA水平在CAFs-CM处理的肝癌Huh7细胞中表达升高，与组学蛋白表达结果一致。westernblot检测结果显示CAFs-CM能够上调肝癌Huh7和HCC-LM3细胞中β-catenin、Ras、p-ERK信号通路关键分子的表达，且Ras/ERK信号通路关键分子升高较为显著。 OPLS-DA分析显示CAFs和NFs两处理组完全分开。根据差异倍数＞1.5或＜0.67标准筛选差异代谢物，结果显示，CAFs-CM处理组和NFs-CM处理组比较共鉴定出83个差异代谢物，其中上调25个，下调58个，分别属于氨基酸、有机酸、核苷酸、脂肪酰类、杂环化合物、苯及其衍生物、辅酶及维生素、碳水化合物、醇及胺类。差异代谢物中氨基酸及其代谢物占比最多，约39％,显著上调的氨基酸有天冬酰胺、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等，而精氨酸、丝氨酸、脯氨酸等明显下调。KEGG通路富集分析发现差异代谢物与糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、三羧酸循环、脂肪酸代谢、色氨酸代谢和谷氨酰胺、谷氨酸代谢相关。 总氨基酸含量检测结果指出CAFs-CM中的氨基酸含量显著高于NFs-CM中的含量;与正常肝脏组织间质液相比，肝癌组织间质液中的氨基酸含量显著增高。细胞功能学实验结果发现，剥夺BCAA和Gln能够明显削弱CAFs-CM促进肝癌细胞增殖、克隆形成和侵袭等恶性生物学行为的能力。细胞周期实验也表明，剥夺BCAA和Gln能够抑制CAFs-CM诱导的肝癌细胞周期进展。接下来westernblot实验结果显示，在完全培养基条件下，CAFs-CM较NFs-CM更能显著增加肝癌Huh7和HCC-LM3细胞中β-catenin、Ras、p-ERK、p-AKT及p-mTOR蛋白的表达。在Huh7细胞中，与NFs-CM处理组相比，剥夺BCAA后，CAFs-CM处理组Huh7细胞中的β-catenin、Ras、p-ERK、p-AKT及p-mTOR蛋白的表达显著降低;而剥夺Gln后，β-catenin和p-AKT蛋白在两组间的表达差异无统计学意义。在HCC-LM3细胞中，与NFs-CM处理组相比，剥夺BCAA后β-catenin、Ras、p-ERK、p-AKT蛋白在两组间的表达差异无统计学意义;而剥夺Gln后β-catenin、Ras、p-ERK、p-AKT及p-mTOR蛋白在CAFs-CM处理的HCC-LM3细胞中表达显著降低。由此可知，剥夺BCAA和Gln能够抑制CAFs-CM诱导肝癌Huh7和HCC-LM3细胞中PI3K/Akt/mTOR、Wnt/B-catenin和Ras/ERK信号通路的激活。 结论: CAFs能够影响肝癌细胞蛋白质表达谱和代谢谱，激活肝癌细胞中信号通路转导以及增强肝癌细胞的氨基酸代谢。剥夺BCAA和Gln能够抑制CAFs诱导的肝癌细胞增殖、克隆形成、侵袭和周期进展以及信号通路的激活;由此可知，CAFs可能通过调控肝癌细胞的氨基酸代谢来影响PI3K/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin和Ras/ERK等信号通路的活化，从而促进肝癌的恶性进展。
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