脂肪酶(三酰甘油水解酶，E.C.3.1.1.3)是重要的工业生物催化剂类型之一，可用于催化非水介质中的酯化、酸解、醇解和酯交换等反应。近年来，酶催化技术逐渐替代化学催化技术，在工业方面广泛应用。Yarrowia lipolytica lipase2(Lip2)作为一种典型的脂肪酶，已被广泛用于科学研究和工业生产，如人类胰腺分泌功能缺陷症的治疗、污水处理和拆分外消旋化合物等方面。稳定性是考评酶分子性能的重要指标，同时热稳定性也是限制脂肪酶应用的关键因素。文献研究表明，Lip2温度稳定性存在缺陷，在40℃以上的温度下失活迅速。为了改善脂肪酶Lip2的热稳定性，本文进行了如下工作: (1)构建毕赤酵母重组菌株成功表达脂肪酶Lip2。扩增得到N端和C端分别携带His-tag的脂肪酶Lip2基因，连接至pPICZαA质粒后，电转至巴斯德毕赤酵母GS115获得重组表达菌株GS115/pPICZαA-Lip2,GS115/pPICZαA-Lip2-N-His，以及 GS115/pPICZαA-Lip2-C-His。发酵验证蛋白表达情况，并以橄榄油乳化法表征酶活。其中，N端携带His-tag的脂肪酶Lip2菌株发酵酶活为155 U/mL,与文献报道数值相近，而C端携带His-tag的脂肪酶Lip2菌株发酵酶活较低。 (2)产脂肪酶Lip2的重组菌株发酵条件的优化。通过探究甲醇补加策略、发酵诱导温度、诱导培养基pH、诱导时长以及抗性平板浓度对发酵后酶活力的影响，得出产酶菌株发酵的最优条件为:重组质粒电转毕赤酵母后运用500 μg/mL YPD-Zeocin抗性平板进行重组产酶菌株的筛选，诱导期发酵培养基缓冲液pH为5.5,在25℃下诱导，每隔12h补加0.5％(v/v)的甲醇，诱导时长为120h。该条件下，筛选得到高产酶重组菌株发酵酶活力为222 U/mL,较优化前提高了 43.2％。 (3)基于酶蛋白二硫键重构技术，定点引入二硫键提高脂肪酶Lip2热稳定性。运用软件Disulfide by Design 2.0预测脂肪酶Lip2中可能形成二硫键的潜在突变位点，并从中筛选5对潜在的二硫键进行实验验证。其中，突变体E6C-Q266C和L64C-D67C的热稳定性提升幅度较大。突变体E6C-Q266C的最适温度为40℃,L64C-D67C的最适温度由野生型的40℃提高到45℃。上述突变体在60℃下的半衰期分别为10.71 min、21.10 min,分别是野生型的2倍和4倍;半失活温度相较于野生型分别提高5.24℃和7.47℃。在催化动力学方面，突变体E6C-Q266C和L64C-D67C对底物对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)的亲和力提高，与野生型脂肪酶Lip2相比催化效率分别提高51.5％和67.8％。 (4)以前述研究结果为基础，构建组合突变体引入两对二硫键，使脂肪酶热稳定性进一步增强。通过对突变体L64C-D67C与E6C-Q266C进行组合，得到突变体2S-64-266;组合突变体L45C-A48C与L64C-D67C,得到突变体2S-45-67。突变体2S-45-67的热稳定性未表现出引入两对二硫键的正向叠加效果。突变体2S-64-266的热稳定性显著提高，最适温度由40℃提高到45℃;在60℃下半衰期为47.6min,是野生型的9.14倍;半失活温度为63.33℃,相较于野生型提高了 8.62℃,较单二硫键突变体L64C-D67C提高1.15℃。在催化效率方面，突变体2S-64-266较野生型Lip2 提高 77.94％。 本研究为提高脂肪酶Lip2的热稳定性提供了一种可行的途径，这种理性设计的方法结合了二硫键预测和空间构型分析，有望广泛应用于其他工业酶的热稳定性改造中。
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