摘要
背景和目的： CAR-T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体 T 细胞)治疗对于血液肿瘤具有较好的抗肿瘤能力，因能够使患者达到较高的完全缓解率而得到广泛认可。CD19在大多数B细胞淋巴瘤、急/慢性淋巴细胞白血病等血液肿瘤细胞的表面存在高表达，这些特征使得CD19在治疗血液肿瘤中是一种非常有价值且安全的免疫治疗靶点。目前，CAR19-T细胞治疗已经取得了显著的成果，是目前最先进的个性化细胞免疫疗法工具。虽然近年来，CAR19-T细胞治疗血液肿瘤已经取得了显著疗效，但仍存在复发率较高及患者疗效不佳的问题。并且在大多数临床试验中，回输至体内的CAR-T细胞在几天到几周内无法检测到，而之所以出现这种状况，有多种原因，如抗原丢失，患者自身不耐受等，还有一种可能就是肿瘤微环境损害了 CAR-T细胞在体内的扩增和持续性。 氨基酸是肿瘤细胞和免疫细胞代谢所需的重要营养物质。T细胞也十分依赖氨基酸运输和代谢以实现它们自身的激活、分化和功能。但是由于肿瘤微环境的特异性，T细胞的代谢能力有所抑制，无法与肿瘤细胞竞争氨基酸的摄取，T细胞功能受损，使得肿瘤细胞促进自身增殖从而发生免疫逃逸。目前，有许多研究集中在通过调节代谢障碍来增强CAR-T细胞的功能及疗效。一种增强C AR-T细胞功能的新方法是上调氨基酸转运蛋白，由于它们的上调是免疫细胞增殖和发挥效应功能所必需的，因此对T细胞进行基因工程改造，使其过表达这些氨基酸转运蛋白可能是免疫治疗的一个值得关注的方向。例如，有研究表明对T细胞进行基因工程使其表达精氨酸琥珀酸合成酶(ASS)和鸟氨酸转甲酰基酶(OTC),可以促进T细胞增殖，从而增强对肿瘤细胞的清除能力。这手段可能会增强CAR-T细胞的代谢适应能力，并成为一种在肿瘤微环境中应对营养应激的新方法，从而提高抗肿瘤免疫疗法。 甲硫氨酸是一种必需氨基酸，可被甲基转移酶转化为甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM),以产生甲基化的底物，包括组蛋白甲基化，因此将甲硫氨酸代谢与表观遗传调控之间联系起来。并且有研究发现在肿瘤免疫微环境中，肿瘤细胞与T细胞竞争摄取甲硫氨酸，破坏了 T细胞的甲硫氨酸代谢，从而降低细胞内甲硫氨酸和甲基供体SAM的水平，组蛋白H3赖氨酸79二甲基化的缺失(H3K79me2)，而H3K79me2的缺失会导致STAT5低表达和T细胞免疫受损。因此，异常的甲硫氨酸代谢可能导致T细胞中特定的组蛋白改变，并导致它们在肿瘤微环境中的功能障碍。甲硫氨酸主要通过溶质载体蛋白家族(SLC)转运到细胞中，包括系统L型和A型转运蛋白。系统L转运蛋白主要负责甲硫氨酸的转运，主要的甲硫氨酸转运体有SLC7A6,SLC1A5,SLC7A5,SLC38A2,SLC43A2,而这几个转运体中，SLC43A2的Km2值达到0.3 uM,其它几个亲和力均不如SLC43A2对甲硫氨酸的亲和力高。因此在CAR-T细胞中过表达甲硫氨酸转运体，改善其甲硫氨酸摄取能力，有望改善CAR-T细胞在肿瘤免疫微环境中甲硫氨酸代谢被破坏的现象，值得研究和明确。 综上所述，本课题研究旨在通过设计一种既能够通过甲硫氨酸转运体SLC 43A2调节甲硫氨酸代谢又同时靶向表达CD19抗原的肿瘤细胞的CAR-T细胞，从而提高CAR-T细胞对甲硫氨酸的摄取，扭转CAR19-T细胞在肿瘤微环境中甲硫氨酸代谢所处的劣势地位，从而增强CAR-T细胞功能、增殖及杀伤效应，达到更好的肿瘤控制效果。 方法： 1.收集CAR19-T细胞回输后完全缓解期和病变进展期患者血清，通过代谢组学检测血清中代谢差异物。 2.通过RT-PCR检测血液瘤患者T细胞与肿瘤细胞上甲硫氨酸转运体的表达差异。 3.收集健康人与肿瘤患者血液，通过流式细胞仪检测T细胞上甲硫氨酸转运体SLC43A2的表达，以及Western Blot检测肿瘤细胞与T细胞上SLC43A2表达。 4.用慢病毒转染的方法构建以CD 19为靶点的CAR-T细胞，并在低甲硫氨酸环境中培养CAR19-T细胞，通过流式细胞仪检测低甲硫氨酸对CAR19-T细胞的影响。 5.用慢病毒转染的方法在CAR19-T细胞基础上构建过表达SLC43A2的CAR-T细胞，通过流式细胞仪检测在低甲硫氨酸培养环境下CAR19-T细胞的活化，增殖及效应功能。 6.通过小动物成像系统检测低甲硫氨酸培养环境下过表达SLC43A后CAR19-T细胞对于Raji细胞与Nalm-6细胞的杀伤能力。 7.NTG小鼠尾静脉回输表达荧光素酶的淋巴瘤细胞系FFluc-Raji,7天后回输不同组CAR-T细胞治疗，通过小动物成像系统检测肿瘤生物学发光，检测CAR19-SLC43A2-T细胞的体内抑瘤能力。 8.NTG小鼠尾静脉回输表达荧光素酶的淋巴瘤细胞系FFluc-Nalm-6,7天后回输不同组CAR-T细胞治疗，通过小动物成像系统检测肿瘤生物学发光，检测CAR19-SLC43A2-T细胞的体内抑瘤能力。 9.NTG小鼠尾静脉回输表达荧光素酶的淋巴瘤细胞系FFluc-Raji,7天后回输不同组CAR-T细胞治疗，通过小动物成像系统检测肿瘤生物学发光，肿瘤消除后，再次回输FFluc-Raji细胞，继续检测肿瘤生物学发光，检测CAR19-SLC43A2-T细胞的体内抑瘤能力。 10.NTG小鼠尾静脉回输淋巴瘤细胞系FFluc-Raji,7天后回输不同组CAR-T细胞治疗，40天后收集血液，流式检测CAR-T细胞的浸润情况，并剥离小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠，对小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠进行H&E染色观察CAR19-SLC43A2-T细胞对于器官是否造成损伤。 11.通过转录组学测序，检测过表达SLC43A2后CAR19-T细胞转录水平的变化。 结果： 1.代谢组学检测结果显示，与CAR19-T细胞回输治疗后的CR组患者相比，PD组甲硫氨酸含量更低。 2.与T细胞相比，肿瘤细胞上甲硫氨酸转运体SLC43A2表达水平较高。 3.肿瘤患者血液中T细胞上甲硫氨酸转运体SLC43A2表达水平低于健康人T细胞。 4.低甲硫氨酸会抑制CAR19-T细胞的活化水平，细胞因子的分泌并影响记忆分化。 5.过表达SLC43A2后CAR19-T细胞的甲硫氨酸摄取能力、活化水平、效应功能以及增殖均得到改善。 6.在低甲硫氨酸环境中过表达SLC43A2后CAR19-T细胞杀伤能力明显增强。 7.NTG小鼠尾静脉回输表达荧光素酶的淋巴瘤细胞系FFluc-Nalm-6,7天后回输不同组CAR-T细胞治疗，通过小动物成像系统检测肿瘤生物学发光，发现过表达SLC43A2的CAR19-T细胞组具有更好的肿瘤控制效果，并且延长了其生存期 8.NTG小鼠尾静脉回输表达荧光素酶的淋巴瘤细胞系FFluc-Raji,7天后回输不同组CAR-T细胞治疗，通过小动物成像系统检测肿瘤生物学发光，与Nalm-6组实验结果一致，过表达SLC43A2后有更好的肿瘤杀伤效果，并且延长了小鼠的生存期。 9.NTG小鼠尾静脉回输表达荧光素酶的淋巴瘤细胞系FFluc-Raji,7天后回输不同组CAR-T细胞治疗，通过小动物成像系统检测肿瘤生物学发光，肿瘤消除后，再次回输FFluc-Raji细胞，继续检测肿瘤生物学发光，发现过表达SLC43A2后的CAR19-T细胞仍然具有较好的肿瘤控制效果。 10.NTG小鼠尾静脉回输淋巴瘤细胞系FFluc-Raji,7天后回输不同组CAR-T细胞治疗，40天后收集血液，流式检测CAR-T细胞的浸润能力，流式结果显示过表达SLC43A2后CAR19-T细胞浸润得到改善，并且在剥离小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠，通过HE染色，镜下观察，并未造成器官损伤。 11.转录组学测序结果显示，过表达SLC43A2后CAR19-T细胞除了半胱氨酸和甲硫氨酸代谢通路明显上调，其它营养物质的代谢通路也明显上调。 结论： 1.当血液瘤患者体内缺乏甲硫氨酸时，则会导致CAR19-T细胞对于血液瘤的疗效不佳。 2.过表达甲硫氨酸转运体SLC43A2能够增强甲硫氨酸摄取，从而提高CAR19-T细胞功能，并增强其肿瘤杀伤功能。
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