摘要
原发性肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，是最常见的恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌是最常见的类型，以下简称肝癌。靶向治疗属于以系统治疗为主的综合治疗方法，索拉非尼是用于晚期肝癌治疗的一线靶向药物，研究表明，索拉非尼可通过多种途径抑制肝癌，如诱导肝癌细胞发生凋亡、抗血管生成等，最新研究表明，索拉非尼还可诱导肝癌细胞发生铁死亡，通过触发铁死亡可增强靶向药物的敏感性。索拉非尼虽然表现出较好的抗肝癌效果，但其在用药过程中不良反应出现较多，并且极易产生耐药性使其临床总体效果受到极大影响。近年来，关于索拉非尼与其他药物联合应用提高索拉非尼的敏感性并降低其耐药性的研究受到越来越多的关注，如人参皂苷Rg3、Rk1等与索拉非尼联合可协同抑制肝癌。人参皂苷衍生物AD-1是人参浆果提取得到的皂苷类衍生物，本课题组前期研究发现，AD-1具有较好的抗结直肠癌作用，但AD-1是否具有抗肝癌作用目前尚未进行有关探索，若将AD-1和索拉非尼联合应用，对肝癌是否起到协同抑制作用，其机制是否与铁死亡有关尚不清楚。 目的:探索人参皂苷衍生物AD-1与索拉非尼联合应用对人肝癌细胞是否具有协同抑制作用，并对其机制进行初步探索，为肝癌的联合治疗方案提供新的理论依据。 方法:体外培养人肝癌细胞株HepG2和Huh7,实验分为对照组、AD-1组、索拉非尼组和联合用药组。通过CCK-8法分别检测AD-1、索拉非尼、AD-1联合索拉非尼对人肝癌细胞活力的影响，计算其细胞增殖率和细胞抑制率，筛选最佳给药浓度。采用平板克隆实验、划痕实验、Transwell实验分别检测AD-1和索拉非尼联合应用对人肝癌细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力的影响。通过SynergyFinder数据分析网站对AD-1和索拉非尼联合用药作用于人肝癌细胞协同作用效果进行预测和分析。为进一步探索AD-1和索拉非尼对人肝癌细胞协同抑制作用机制是否与铁死亡有关，对铁死亡相关指标进行检测，包括细胞内铁含量、还原型谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量，以及活性氧(ROS)水平进行测定，Western blot法检测铁死亡相关蛋白的表达水平，主要为SLC7A11、GPX4、FTH1、SOD1,最后通过Western blot 法检测 KEAP1/NRF2/HO-1 通路相关蛋白 KEAP1、NRF2、HO-1 蛋白表达水平，检验AD-1和索拉非尼联合应用情况下协同诱导人肝癌细胞发生铁死亡是否与KEAP1/NRF2/HO-1通路有关。 结果:1.CCK-8结果表明，AD-1和索拉非尼均可抑制HepG2和Huh7细胞增殖，且AD-1和索拉非尼联合应用比单独使用AD-1或索拉非尼对肝癌细胞的抑制效果更好;细胞平板克隆实验结果表明，与对照组和单独用药组相比，AD-1和索拉非尼联合应用显著减少细胞集落形成;划痕实验结果显示，AD-1和索拉非尼联合应用组较对照组和单独用药组显著抑制细胞的迁移;Transwell实验结果表明，AD-1和索拉非尼联合可抑制肝癌细胞的侵袭能力，且联合用药组抑制效果优于对照组和单独用药组。 2.SynergyFinder数据分析结果表明，AD-1和索拉非尼联合应用可对肝癌细胞产生协同抑制作用，并且AD-1和索拉非尼联合应用对Huh7细胞的协同抑制作用优于对HepG2细胞的协同抑制作用效果。 3.基于TCGA数据库分析铁死亡关键蛋白GPX4在肝细胞癌肿瘤组织和正常组织表达情况，结果表明，与正常组织相比，GPX4在肝癌组织中表达增多，说明癌症组织中铁死亡受到抑制。通过 Western blot结果表明，AD-1和索拉非尼均可下调铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4、FTH1、SOD1蛋白表达水平，联合用药组较对照组和单独用药组相比，铁死亡相关蛋白表达水平下降更明显;ELISA结果显示，与对照组和单独用药组相比，AD-1和索拉非尼联合应用可使细胞内Fe2+、GSH含量减少、MDA含量增加，上述情况均可被铁死亡抑制剂Fer-1逆转;活性氧（ROS）荧光检测发现，与对照组和单独用药相比较，AD-1和索拉非尼联合应用ROS水平明显增加，加入铁死亡抑制剂Fer-1后，ROS水平有所恢复。 4.Westem blot结果表明，HepG2和Huh7细胞KEAP1、NRF2、HO-1蛋白表达存在差异，与协同作用效果差异呈正相关;Huh7细胞使用药物处理后，联合用药组与对照组和单独用药组相比，AD-1和索拉非尼联合应用组KEAP1蛋白表达水平增加，NRF2、HO-1蛋白表达水平下降。 结论:人参皂苷衍生物AD-1和索拉非尼联合应用对人肝癌细胞产生协同抑制作用，其作用机制可能与调控KEAP1/NRF2/HO-1通路诱导人肝癌细胞发生铁死亡有关。
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