摘要
酶作为一类催化生化反应的蛋白质，广泛参与了细胞中的生理病理过程，多种疾病的发生，往往伴随蛋白酶的异常表达。高尔基体是所有真核生物都具备的一个光面膜性细胞器，其主要职责是对内质网合成的蛋白质进行加工、分类和运输，以便将它们转运至质膜、溶酶体或细胞外。而生物体病变过程中，高尔基体结构的改变会损害其加工功能，进而影响分选相应蛋白到神经元特定区域的准确性。多种蛋白酶诸如糜蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、羧酸酯酶等，众多研究报道表明他们会在肿瘤细胞中异常表达。因此，精确检测酶活性及对酶的原位细胞成像，对于理解生物体的生命活动和疾病的早期诊断发生具有重要的意义。 荧光探针由于其高选择性、高灵敏度、响应迅速等优点在各类检测手段中脱颖而出，已经大规模地应用于免疫分析、生化传感、医学诊断成像、食品环境检测等一系列科学研究领域。与其他一些常见的细胞器靶向探针相比，高尔基体靶向近红外荧光探针目前还处于起步阶段，对酶特异性响应的高尔基体靶向荧光探针有待进一步开发。因此，开发新型高尔基靶向荧光探针是极具挑战性且非常必要的研究。本文构建了三种酶激活的“点亮”型近红外荧光探针，并分别对癌症相关的蛋白酶进行了检测，具体研究内容如下: 1、以半花菁衍生物作为荧光团，引入对氨基苯磺酰胺作为高尔基定位基，分别以4-溴丁酸酯（CYB-C1）和3-苯基丙酸酯（CYB-C2）为识别基团，设计合成了两个特异性响应糜蛋白酶的高尔基体靶向近红外荧光探针。其中，探针CYB-C2,具有更好的选择性，良好的灵敏度，检测限可达到13.46 ng/mL，在pH 4.0-10.0范围内可稳定存在等优点。探针CYB-C2与糜蛋白酶响应后颜色从蓝色变为浅蓝色，具有裸眼可视化功能。同时，探针可用于细胞与斑马鱼中内源性糜蛋白酶的检测;探针共定位系数达到0.8,表现出良好的高尔基体靶向效果。 2、基于乙酰胆碱酯酶与丁酰胆碱酯酶在活性口袋的结构差异和空间位阻考虑，分别以酰基环丙烷，酰基环丁烷，酰基环戊烷，酰基环己烷为识别基团，以CYOH为荧光团，设计合成了一系列荧光探针，其中CYB-B4吸收/发射波长分别为（675 nm/710 nm）,对丁酰胆碱酯酶响应灵敏度高，检测限低至2.2 mU/mL;探针与BChE响应迅速，36 min可完全响应;此外，CYB-B4可有效排除乙酰胆碱酯酶的干扰，并有着较低的生物毒性。细胞成像结果表明，探针CYB-B4具有较好的高尔基共定位能力，共定位系数为0.75,并可应用于细胞内源性丁酰胆碱酯酶的检测。 3、设计合成了一系列对羧酸酯酶响应的近红外荧光探针，以选择性为向导，筛选出可对CEs特异性识别的近红外荧光探针CYB-E4。CYB-E4选择性良好，对多种活性小分子未见响应;探针与羧酸酯酶响应迅速，可在30 min响应完全，且响应灵敏，检测限低至0.2 mU/mL;同时，探针在不同pH下表现出良好的稳定性。此外探针可以成功应用于活细胞、斑马鱼和金黄色葡萄球菌中羧酸酯酶的成像检测，并具有一定的抑菌活性，其MIC值为16μg/mL。
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