摘要
背景和目的： 胃癌在全球癌症死亡人数中排名第四，在我国仅次于肺癌和肝癌，严重威胁我国人民的健康。手术和辅助放化疗适用于可切除胃癌患者的早期治疗，而对不可切除或转移性胃癌患者的治疗主要是化疗与靶向药物治疗。目前，临床上用于胃癌治疗的靶向药物仅针对人表皮生长因子受体2(HER2)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)和程序性死亡受体1(PD-1)三个靶点。因此，迫切需要开发新的抗胃癌药物靶点。临床肿瘤患者数据显示编码PI3Kα催化亚基p110α的PIK3C4在胃癌等多种类型实体瘤中高频突变激活，是一确证的抗癌靶标。目前,已有多个PI3Kα选择性抑制剂进入临床试验，以单用或者联用形式治疗乳腺癌、结直肠癌等西方国家高发的实体瘤。其中，Alpelisib(BYL719)已获FDA批准，与氟维司群联合用于雌激素受体阳性(HR+)、HER2-且PIK3CA突变的特定乳腺癌患者的治疗。基于PIK3CA在胃癌中的高频突变，本课题组前期评价了BYL719的抗胃癌活性。结果显示BYL719差异性抑制不同胃癌细胞增殖，但介导胃癌细胞对PI3Kα抑制剂响应差异的机制尚不清楚。因此，本课题拟进一步探究介导胃癌细胞对PI3Kα抑制剂响应差异的机制，以期发现指示或预测胃癌细胞对PI3Kα抑制剂敏感的生物标志物。 方法和结果： 1.PIK3IP1上调和c-Myc下调可监测胃癌细胞对BYL719的敏感性 首先用SRB实验验证了 BYL719差异性抑制不同胃癌细胞的增殖。用免疫印迹实验检测PI3K信号通路对BYL719的响应，结果显示BYL719可同时抑制敏感和耐药胃癌细胞内AKT和S6磷酸化。接着，用人p-RTKs阵列试剂盒和受体酪氨酸激酶(RTKs)抑制剂探究特定RTKs在胃癌细胞对BYL719响应中发挥的作用，结果表明抑制特定RTKs的激活不影响胃癌细胞对PI3Kα抑制剂的响应。通过RNA-seq技术进一步探究介导胃癌细胞对BYL719敏感的潜在机制，PCA结果显示BYL719可明显影响敏感胃癌细胞的转录组学，但对耐药胃癌细胞的转录组影响较小。使用火山图分析BYL719对敏感胃癌细胞NCI-N87转录组的影响，结果表明BYL719可显著上调PI3K负调节因子PIK3IP1的表达。RT-qPCR技术和免疫印迹实验证明BYL719仅上调敏感胃癌细胞内PIK3IP1的转录水平和蛋白表达水平，提示PIK3IP1的上调可作为胃癌细胞对PI3Kα抑制剂BYL719敏感的监测生物标志物。进一步挖掘RNA-seq数据，我们发现BYL719能够同时下调敏感和耐药胃癌细胞的mTORC1信号、氧化磷酸化和Myc靶V1基因集等，但是Myc靶V2基因集仅在敏感胃癌细胞中被BYL719显著下调，而在耐药胃癌细胞中受BYL719影响较小。为此，我们使用免疫印迹实验检测了BYL719对多个胃癌细胞内c-Myc的影响，结果显示BYL719下调敏感胃癌细胞中的c-Myc蛋白表达，对耐药胃癌细胞中的c-Myc几乎无作用。接着，我们构建了敏感胃癌细胞NCI-N87异种小鼠移植瘤动物模型，检测了 BYL719的抗肿瘤效果，并检测了 PIK3IP1的表达情况，结果显示BYL719显著抑制体内肿瘤的生长，并上调了 PIK3IP1的表达。 2.下调c-Myc介导BYL719的抗胃癌活性 基于PIK3IP1上调和c-Myc下调可监测胃癌细胞对BYL719的敏感性，我们推测PIK3IP1和c-Myc可能参与BYL719的抗胃癌活性。首先，通过生物信息学方法调研了 PIK3IP1在胃癌患者样本中的表达情况，发现肿瘤组织中PIK3IP1的表达较低。使用shRNA实验和细胞瞬时转染实验分别敲减和上调细胞内PIK3IP1,检测PIK3IP1的下调和上调对BYL719抗胃癌活性的影响，结果表明PIK3IP1表达水平的改变对BYL719的抗胃癌活性的影响比较微弱，提示PIK3IP1上调在BYL719抗胃癌活性中发挥次要作用。使用生物信息学方法调研MYC在胃癌患者样本中的表达情况，发现肿瘤组织中MYC显著高表达。使用siRNA实验敲减c-Myc,探究c-Myc下调对BYL719抗胃癌活性的影响，结果表明敲减c-Myc显著增强BYL719的抗胃癌活性。使用SRB实验和细胞克隆形成实验检测HDAC抑制剂伏立诺他（SAHA）对BYL719抗胃癌活性的影响，结果显示SAHA显著增强耐药胃癌细胞对BYL719的敏感性。使用免疫印迹实验探究两药联用的抗肿瘤作用机制，结果表明SAHA与BYL719联用协同下调耐药胃癌细胞中c-Myc的表达。 结论： 1.PIK3IP1的上调和c-Myc的下调可作为生物标志物监测胃癌细胞对BYL719的敏感性。 2.上调PIK3IP1不能克服胃癌细胞对BYL719的原发性耐药，下调c-Myc是介导PI3Kα抑制剂BYL719抗胃癌活性的关键。
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