研究背景及目的 蒽环类抗肿瘤药物阿霉素（Doxorubicin，DOX)对各个时期的肿瘤均有杀伤作用，广泛应用于血液系统肿瘤及实体肿瘤的治疗。然而，由于DOX进入体内后会引发持续的化学反应及多种毒副作用，如:肝脏损伤、心肌毒性、骨髓抑制，导致其临床应用受到了诸多限制。肝脏是受DOX副作用影响最严重的器官之一，DOX可导致肝脏纤维化、炎症和氧化应激损伤的增加，且DOX引起的急性肝损伤可危及癌症患者生命。然而，目前尚无临床公认的药物可以有效缓解DOX引起的肝毒性。因此，在不削弱抗肿瘤疗效的前提下，探寻预防或减少DOX所致肝脏损伤的治疗策略，提高癌症幸存者的生存质量尤为重要。虽然DOX诱导肝脏损伤的机制十分复杂，但已有研究指出氧化应激是其中的关键因素。具有蒽醌结构的DOX可在体内代谢成不稳定的半醌中间体，通过氧化还原循环产生过量的活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS)，最终导致肝细胞凋亡。因此，可以通过抑制氧化应激来预防或治疗DOX引起的肝脏损伤。 成纤维细胞生长因子1（Fibroblastgrowthfactor1,FGF1)属于FGF家族的重要成员之一，具有广泛的生物学活性。FGF1可以促进肝源性干细胞的分化和成熟，并且可以通过抑制氧化应激而治疗肝脏疾病。然而，FGF1具有强大的有丝分裂活性，可诱导多种细胞分化、增殖，长期使用会增加致癌风险，这大大限制了其临床应用。有研究指出，多种天然产物可以抑制肿瘤的发生和发展，且在多种类型的肿瘤治疗过程中不会引起任何副作用。这提示我们可以通过寻找一种天然产物在抑制FGF1促增殖活性的前提下，进一步促进其缓解肝脏氧化应激的效果。 白藜芦醇（Resveratrol,RES)是存在于葡萄、花生等植物中的天然多酚类抗毒素，已被广泛用作膳食补充剂，具有来源广、毒性小、价格低、可药食两用以及适合长期用药等优点。此外，RES作为一种天然抗氧化剂，对于改善氧化应激引起的疾病也非常有效，而且还可以预防或减缓恶性肿瘤的进展并增加DOX的抗癌效果。基于上述研究，我们假设天然产物活性成分RES与FGF1联合应用可以抑制FGF1的有丝分裂活性，增强DOX的抗癌效果，延缓癌症的进展，同时发挥其抗氧化作用减轻DOX所致的肝脏毒性。在验证上述假设后，我们将进一步探究RES与FGF1联合用药改善DOX诱导的急性肝脏损伤的具体分子机制。 研究方法 1.RES与FGF1联合用药可以改善DOX所致急性肝脏损伤 1.1DOX所致小鼠急性肝损伤模型的构建及RES与FGF1联合用药的干预 将C57BL/6J雄性小鼠随机分为5组（每组6只)，利用腹腔注射法构建急性肝损伤小鼠模型。根据分组连续7天腹腔注射RES（10mg/kg/day)、FGF1（0.5mg/kg/day)或相同体积的生理盐水。7天后单次腹腔注射DOX（20mg/kg)或相同体积的生理盐水，24h后给予各组小鼠安乐死。 1.2RES与FGF1联合用药可以抑制FGF1的促增殖活性并增强DOX对肿瘤细胞增殖的抑制效果 使用CellCountingKit-8（CCK-8)试剂盒测定HepG2细胞的活力。 1.3RES与FGF1联合用药可以改善DOX所致肝脏功能障碍与结构紊乱 （1)根据小鼠体重和肝脏重量计算各组小鼠肝脏指数。 （2)使用天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartatetransaminase,AST)测试盒与丙氨酸氨基转移酶（Alaninetransaminase,ALT)测试盒检测小鼠血清中AST、ALT含量，对小鼠肝脏功能进行评估。 （3)通过苏木素-伊红（Hematoxylinandeosin,H&E)染色法检测小鼠肝脏的组织学形态，对小鼠肝脏结构紊乱程度进行评估。 1.4RES与FGF1联合用药可以减轻DOX所致肝脏炎症 （1)使用免疫组织化学（Immunocytochemistry,IHC)染色检测小鼠肝脏中炎症因子:肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)的蛋白表达水平。 （2)使用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timequantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)检测小鼠肝脏炎症因子:Tnfa、白介素1β（Interleukin-1β,Il1b)和Il6的mRNA水平。 1.5RES与FGF1联合用药可以减少DOX所致肝细胞凋亡 使用原位末端标记（TerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnick-endlabeling,TUNEL)染色检测小鼠肝脏细胞的凋亡率。 1.6RES与FGF1联合用药可以改善DOX所致肝脏氧化应激损伤 （1)使用二氢乙啶（Dihydroethidium,DHE)染色评估小鼠肝脏中活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS)的生成情况。 （2)使用IHC染色检测小鼠肝脏氧化应激标志物:3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT)和4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE)的生成情况。 2.RES与FGF1联合用药恢复DOX诱导的核NRF2及其下游抗氧化酶表达的下降 （1)使用RT-qPCR检测小鼠肝脏中过氧化氢酶（Catalase，Cat)、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,Sod)、血红素氧合酶（Hemeoxygenase-1,Ho-1)和醌氧化还原酶（NAD（P)Hquinonedehydrogenase1,Nqo1)的mRNA水平。 （2)使用westernblot检测小鼠肝脏中总NRF2（t-NRF2)及核内NRF2（n-NRF2)的蛋白表达水平以及HO-1的蛋白表达水平。 （3)使用免疫荧光（Immunofluorescent,IF)染色检测小鼠肝脏中HO-1和NQO1的蛋白表达水平。 3.RES与FGF1联合用药抵御DOX诱导的原代肝细胞氧化应激损伤依赖于NRF2 （1)利用短发夹RNA（ShorthairpinRNA,shRNA)转染技术沉默原代肝细胞中的Nrf2基因，然后根据分组使用DOX（1μM)，RES（20μM)和FGF1（100ng/ml)分别或同时处理原代肝细胞24h。 （2)使用westernblot检测原代细胞中NRF2核内蛋白的表达水平和HO-1的蛋白表达水平。 （3)使用DHE染色检测原代肝细胞中ROS的生成情况。 （4)使用RT-qPCR检测原代肝细胞中Cat、Sod、Ho-1和Nqo1的mRNA水平。 4.AMPK介导了RES与FGF1联合用药对NRF2的激活 （1)利用shRNA转染技术沉默原代肝细胞中的Ampk基因或Nrf2基因，使用DOX（1μM),RES（20μM)和FGF1（100ng/ml)分别或同时处理原代肝细胞24h。 （2)使用DHE染色检测原代肝细胞中ROS的生成情况。 （3)使用RT-qPCR检测Cat、Sod、Ho-1和Nqo1的mRNA水平。 （4)使用westernblot检测原代肝细胞中p-AMPK、AMPK和HO-1的蛋白表达水平以及NRF2的核内蛋白表达水平。 研究结果 1.RES与FGF1联合用药可以改善DOX所致急性肝脏损伤 1.1RES与FGF1联合用药可以抑制FGF1的促增殖活性并增强DOX对肿瘤细胞增殖的抑制效果 CCK-8结果表明RES可以有效抑制FGF1的促增殖活性，并且RES与FGF1联合用药可以增强DOX对肿瘤细胞的抑制效果。 1.2RES与FGF1联合用药可以改善DOX所致肝脏功能障碍与结构紊乱 检测结果显示，与Ctrl组相比，DOX组小鼠肝脏指数、血清ALT和AST的含量明显升高，RES或FGF1的单独治疗可以显著降低肝脏指数、ALT和AST的含量，而RES和FGF1联合治疗进一步降低了上述指标。H&E染色结果显示，DOX处理后的肝脏切片可见广泛的肝细胞坏死和空泡样变性，而RES或FGF1的单独治疗可以改善DOX所致肝脏结构紊乱，RES和FGF1联合治疗可进一步减轻肝脏结构紊乱。 1.3RES与FGF1联合用药可以减轻DOX所致肝脏炎症 IHC染色和RT-qPCR结果显示，与Ctrl组相比,DOX组小鼠肝脏炎症标志物TNF-α的蛋白水平及其mRNA水平，以及Il1b和Il6的mRNA水平明显升高。RES或FGF1的干预可明显降低DOX组小鼠上述肝脏炎症指标，RES与FGF1联合用药组的改善效果更加显著。 1.4RES与FGF1联合用药可以减少DOX所致肝细胞凋亡 TUNEL染色结果显示，与Ctrl组相比，DOX组小鼠肝脏中TUNEL阳性细胞数明显增加，而RES或FGF1的干预明显减少了肝脏中TUNEL阳性细胞数，RES与FGF1的联合应用对小鼠肝脏细胞凋亡产生了进一步的抑制效果。 1.5RES与FGF1联合用药可以改善DOX所致肝脏氧化应激损伤 DHE染色和IHC染色结果显示，与Ctrl组相比，DOX组小鼠肝脏的ROS及氧化应激标志物3-NT和4-HNE生成明显增加，但在RES或FGF1给药组中上述指标的变化均明显降低，RES与FGF1联合给药后进一步抑制了上述指标的升高。 2.RES与FGF1联合用药恢复DOX诱导的核NRF2及其下游抗氧化酶的表达下降 结果显示，RES或FGF1单独给药可以恢复DOX引起的小鼠肝脏n-NRF2蛋白表达、HO-1和NQO1蛋白表达以及Cat、Sod、Ho-1和Nqo1的mRNA水平的下降，RES与FGF1的联合用药进一步改善了DOX引起的这一趋势。 3.RES与FGF1联合用药抵御DOX诱导的原代肝细胞氧化应激损伤依赖于NRF2 DHE染色结果显示，Nrf2的敲低完全消除了RES和/或FGF1对DOX诱导的氧化应激的保护作用。RT-qPCR结果显示，Nrf2-shRNA的使用显著削弱了RES和/或FGF1增加抗氧化因子Cat、Sod、Ho-1和Nqo1的mRNA水平的能力。以上实验结果表明，RES与FGF1通过上调NRF2的表达减轻DOX所致的氧化应激损伤。 4.AMPK介导了RES与FGF1联合用药对NRF2的激活 Westernblot检测结果显示，与Ctrl组相比，在DOX处理的小鼠肝脏中，AMPK的磷酸化水平降低，而RES或FGF1的干预可以逆转这些变化，RES与FGF1的联合应用进一步促进了p-AMPK的蛋白表达。这表明，AMPK途径参与了RES和FGF1联合应用对于DOX所致急性肝损伤的保护作用。 在原代肝细胞中转染Ampk-shRNA后，与NC-shRNA组相比，Ampk敲低组显著增加了DOX暴露后原代肝细胞中ROS的产生，也取消了RES和/或FGF1对DOX所致原代肝细胞氧化应激损伤的保护作用。进一步研究发现，Ampk-shRNA的使用破坏了RES和/或FGF1干预逆转DOX引起的n-NRF2及其下游抗氧化物酶Cat、Sod、Ho-1和Nqo1的mRNA水平和HO-1蛋白水平的下降的作用。此外，Nrf2基因沉默未影响p-AMPK的蛋白表达。上述实验结果表明，RES和FGF1共同作用可激活AMPK,进而刺激NRF2入核，以抑制DOX诱导的肝脏氧化应激。 研究结论 1.RES和FGF1联合用药可改善DOX所致的肝脏功能障碍、肝脏结构紊乱、炎症、凋亡和氧化应激损伤。 2.RES与FGF1联合用药抵御DOX诱导的原代肝细胞氧化应激损伤依赖于NRF2 3.RES与FGF1联合用药是通过激活AMPK进而增加n-NRF2及其下游抗氧化因子的表达，从而改善DOX诱导氧化应激损伤。
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