摘要
目的: 非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）作为当今世界第一大慢性疾病，严重危害了人民的生活健康，对全球的医疗卫生系统产生了沉重的负担。截至目前，只有一款药物（Resmetirom）被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准用于治疗伴有肝纤维化的NASH患者，整个市场仍面临着巨大的空白。因此开发有效的NAFLD治疗药物具有重要的社会意义和经济价值。中药作为中国传统医学的核心组成部分，拥有着数千年的历史与经验，其中有许多的活性成分亟待被挖掘。黄芪作为一种传统保肝护肝药物，在中医药治疗NAFLD的方剂中被广泛应用。黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分之一，多种研究证据表明黄芪甲苷在NAFLD的相关治疗中发挥着独特的作用，但因其水溶性差和生物利用度低，使其应用受到了较大的抑制。基于此，课题组前期对黄芪甲苷进行结构优化性改造，开发了一系列黄芪甲苷衍生物，并筛选到了一个全新的小分子化合物HHQ16,具有良好的稳定性、安全性和高效的生物利用度。HHQ16灌胃给药可显著改善多种NAFLD模型的相关症状，但该药物的具体靶点以及药物作用的药理学机制尚不明确。因此，本课题旨在筛选并确认HHQ16潜在的药物结合靶标，并对HHQ16改善NAFLD可能涉及到的作用机制进行初步探讨，以期为HHQ16作为NAFLD治疗药物的研发奠定理论基础。 方法: 利用游离脂肪酸（Free fatty acids，FFAs;油酸与棕榈酸的混合溶液）处理小鼠AML12肝细胞诱导体外脂质蓄积模型;利用CCK-8检测细胞活性、油红O染色检测中性脂质蓄积综合评判HHQ16对游离脂肪酸诱导的脂质蓄积的治疗效果;利用60％高脂饲料（High fat diet，HFD）喂养16周诱导小鼠NAFLD;利用肝脏组织病理学（HE染色结合NAS评分，油红染色、MASSON染色、F4/80免疫组化）评价HHQ16药效;利用AKT酶活性体外检测试剂盒检测AKT酶活性;利用瞬时转染技术（小干扰RNA;Small interfering RNA,siRNA）干扰肝细胞内AKT1和AKT2的表达;利用AKT抑制剂抑制AKT酶的活性;利用shRNA结合TBG启动子构建质粒进行肝脏特异性AKT1敲减，并利用腺相关病毒包装后尾静脉给药方式注入小鼠体内;利用药物亲和反应的靶点稳定性（Drug affinity responsive target stability，DARTS）联合 LC-MS/MS 蛋白组学，结合转录组学（RNA-seq）联合分析筛选HHQ16的潜在结合靶标;利用生信叠加分析提示HHQ16发挥改善脂质蓄积作用可能涉及的信号通路及分子机制;利用药物亲和反应的靶点稳定性（Drug affinity responsive target stability,DARTS）、细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）、表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）等分子对接技术验证HHQ16与靶蛋白-AKT1的直接结合关系，分析HHQ16与靶蛋白之间的结合特点与作用模式;利用RT-qPCR技术检测细胞、组织中的mRNA表达情况;利用Western Blot技术检测细胞、组织中蛋白的表达情况。 结果: 一、基于多组学的HHQ16靶标筛选 （一）HHQ16改善FFAs诱导的肝细胞脂质蓄积剂量探索 CCK-8、油红染色结果均显示，100 nM和1000nM的HHQ16均可显著改善由于游离脂肪酸堆积所导致的脂质沉积，增加细胞活力，发挥对肝细胞的保护作用，且治疗效应相似，因此选择100 nM剂量的HHQ16进行后续的实验。 （二）转录组学差异基因的筛选与分析 在脂质蓄积细胞模型上给药HHQ16后，676个基因发生了显著性变化，其中包括了246个上调基因以及430个下调基因。对筛选到的差异基因进行富集分析发现，在疾病谱方面HHQ16与NAFLD显著相关，在信号通路方面与PI3K/AKT细胞信号转导通路相关性最高。 （三）转录组学与DARTS结合LC-MS/MS蛋白组学联合分析 通过对课题组前期利用DARTS联合LC-MS/MS调取HHQ16获取的HHQ16潜在结合靶标再分析。联合RNA-seq得到的DEGs,共同构建蛋白互作网络（Protein-Protein Interaction Networks,PPI）,结合社交网络学分析方法，以中介中心性（Betweenness）大于2,356.962,接近中心性（Closeness）大于3.162× 10-4,度中心性（Degree）大于9.609为条件，综合筛选获得185个枢纽基因。按照Degree值大小进行排序，绘制蛋白与蛋白互作网络，结果显示AKT1的Degree值最高。提示HHQ16很可能是通过直接结合AKT1，从而影响PI3K/AKT信号通路发挥作用的。 二、HHQ16结合并激活靶标AKT1 （一）HHQ16特异性结合AKT1 DARTS、CETSA结果表明，HHQ16能够增加AKT1与AKT2蛋白的酶稳定性与热稳定性，但不影响AKT3，提示HHQ16可能结合AKT1和AKT2。进一步利用SPR实验验证，结果表明HHQ16能够与AKT1相结合，平衡解离常数为12.7 μM;而与AKT2无法拟合平衡解离常数，说明两者不存在特异性结合。以上结果说明HHQ16可以特异性地结合AKT1亚型。 （二）HHQ16激活体外AKT酶活性 在AML12肝细胞上，给药100 nM HHQ16后检测总 AKT酶活性，结果提示HHQ16能够显著提高体外AKT激酶活性。 （三）HHQ16激活肝细胞AKT及下游信号 在AML12肝细胞上，HHQ16能够呈现剂量依赖性的激活AKT及其下游mTOR与FoxO1的磷酸化。此外，在热孵育情况下，HHQ16能够延长磷酸化AKT的去磷酸化过程。以上结果表明HHQ16能够激活AKT及其下游信号。 （四）HHQ16特异性激活AKT1 使用siRNA对AKT1与 AKT2的表达进行干扰，结果显示:在干扰 AKT1后，HHQ16对AKT及其下游信号蛋白的激活作用被阻断了，而干扰AKT2不影响HHQ16对AKT及其下游信号蛋白的激活。这些结果表明HHQ16通过激活AKT1实现对AKT及其下游信号蛋白的激活。 三、HHQ16通过AKT1调控脂质代谢改善NAFLD （一）HHQ16通过AKT1改善FFAs诱导的细胞脂质蓄积 使用AKT抑制剂抑制AKT活性，可逆转HHQ16对于FFAs诱导所致的脂质沉积、细胞活性降低的治疗作用。利用siRNA技术干扰AKT1或AKT2表达，结果显示仅在AKT1被干扰的情况下，HHQ16对于FFAs诱导所致的脂质沉积、细胞活性降低的治疗作用被阻断了，而干扰AKT2不影响HHQ16药效。以上结果说明HHQ16通过AKT1发挥改善FFAs诱导所致脂质蓄积、增加肝细胞存活的作用。 （二）HHQ16通过AKT1调控脂代谢关键基因 对转录组数据再分析，结果提示HHQ16给药后脂质代谢通路受到了较大影响。经RT-qPCR对脂质代谢通路中相关基因进行检测，结果表明HHQ16可抑制脂质合成关键基因（Fasn、Srebp1-c、Acc1、Acox）,激活脂质分解代谢相关基因（Ppar-α、Ppar-γ、Cyp7a1）,并且这些基因的表达在AKT1被干扰后不再受HHQ16影响。以上结果说明HHQ16通过调控脂质代谢发挥减轻脂质蓄积的治疗作用。 （三）HHQ16通过AKT1改善小鼠NAFLD 以C57BL/6J小鼠为背景，经过16周的高脂饮食诱导，建立小鼠NAFLD模型。构建shAkt1干扰质粒，添加肝脏特异性启动子TBG进行表达调控，在造模第13周，通过尾静脉注射的方式实现小鼠肝脏AKT1的特异性干扰。造模成功后，以胃内注射方式给予HHQ16处理4周，通过组织病理学染色判断HHQ16对NAFLD小鼠肝脏病理的改善作用是否通过AKT1介导的。结果表明HHQ16能够改善对照组小鼠肝脏病理学NAS评分（包括脂质沉积、纤维化、炎性浸润），但在肝脏特异性敲除AKT1小鼠上，HHQ16的上述改善作用均消失。 （四）HHQ16通过AKT1调控脂代谢相关基因，治疗小鼠NAFLD 在动物模型肝组织上，通过RT-qPCR检测筛选到的脂质调控相关基因的表达。结果显示，在野生型小鼠上，HHQ16能够通过抑制肝脏脂质合成相关基因（Fasn、Srebp1-c、Acc1）,激活脂质代谢相关基因（Ppar-α、Ppar-γ、Cyp7a1），调节脂质代谢，但在AKT1肝脏特敲小鼠上，HHQ16调控这些基因表达的作用消失。 结论: HHQ16通过直接结合并激活AKT1及下游信号通路，进而调控脂质代谢相关基因表达，发挥降低肝细胞脂质沉积、保护肝细胞的作用，最终改善NAFLD。
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