摘要
目的:研究草苁蓉多糖（Boschnikia rossica polysaccharides,BRPS）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的THP-1巨噬细胞炎症反应的影响。 方法:将 THP-1 单核细胞用佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）分化为巨噬细胞。用LPS诱导THP-1巨噬细胞建立炎症模型。用LPS+ATP诱导THP-1巨噬细胞建立炎症小体模型。使用CCK-8法检测细胞存活率，使用酶联免疫吸附（enzyme-linked imnuinosorbent assay,ELISA）法检测 THP-1 巨噬细胞上清液中白介素-1β（interleukin-β,IL-1β）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）以及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）含量，使用微板法检测THP-1巨噬细胞乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量，使用DCFH-DA法观察 THP-1 巨噬细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，使用 Hoechst/PI双染法观察THP-1巨噬细胞损伤情况，使用JC-1法检测THP-1巨噬细胞线粒体膜电位，使用蛋白印迹法检测信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）、环氧合酶-2（cyclooxygenase,COX-2）、高迁移率族蛋白 B1（high mobility group box 1 protein,HMGB1）、NOD 样受体家族热蛋白结构域相关蛋白 3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspasel）、消皮素 D（gasdermin D,GSDMD）、IL-1β、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和核转录因子-κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）蛋白表达情况。 结果:1、0～200mg/L BRPS对THP-1巨噬细胞存活率无显著影响（P＞0.05）。2、构建LPS诱导的巨噬细胞炎症模型。当100～2,000 μg/L的LPS作用于THP-1巨噬细胞，存活率均在90％以上（P＞0.05）。LPS刺激后，细胞上清液中IL-6含量升高（P＜0.01）,表明THP-1巨噬细胞炎症模型构建成功。ELISA检测结果显示，LPS处理后THP-1巨噬细胞培养液IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高（P＜0.01）;BRPS预处理后细胞培养液IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著降低（P＜0.01）。Western blotting检测结果显示，LPS处理后THP-1巨噬细胞p-STAT3、COX-2、HMGB1、NLRP3、Caspase1、GSDMD-N 端片段、IL-1β 蛋白表达显著上调（P＜0.05）;BRPS 预处理后 THP-1 巨噬细胞 p-STAT3、COX-2、HMGB1、NLRP3、Caspase1、GSDMD-N端片段、IL-1β蛋白表达显著下调（P＜0.05）。3、建立LPS联合ATP诱导的巨噬细胞炎症小体模型。当1～4mmol/LATP与LPS处理后THP-1巨噬细胞细胞存活率均小于90％（P＜0.05）;但IL-1β蛋白表达水平显著上升（P＜0.05）。LPS+ATP处理后THP-1巨噬细胞LDH水平显著升高（P＜0.05）;BRPS预处理后THP-1巨噬细胞LDH水平显著降低（P＜0.05）。Western blotting检测结果显示，LPS+ATP处理后THP-1巨噬细胞NLRP3、Caspase 1、IL-1β蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），GSDMD蛋白表达显著下调（P＜0.05）;BRPS预处理后THP-1 巨噬细胞NLRP3、Caspase 1、IL-1β蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,GSDMD蛋白表达显著上调（P＜0.05）。4、DCFH-DA检测结果显示，LPS处理后THP-1巨噬细胞ROS水平明显增强;BRPS预处理后ROS水平明显降低。5、JC-1检测结果显示,LPS处理后THP-1巨噬细胞线粒体跨膜电位明显减低;BRPS预处理后THP-1巨噬细胞线粒体跨膜电位显著增加。6、Hoechst/PI检测结果显示，LPS处理后THP-1巨噬细胞损伤程度显著增加;BRPS预处理后THP-1巨噬细胞损伤程度显著减弱。7、Western blotting检测结果显示，LPS处理后THP-1巨噬细胞p-P38、p-ERK和p-JNK蛋白表达水平增加（P＜0.05）;BRPS预处理后THP-1巨噬细胞p-P38、p-ERK和p-JNK蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。采用 MAPK 通路抑制剂（SB203580、U0126、SP600125）进行验证。LPS 处理后 SB203580 组、BRPS 组、SB203580+BRPS 组 THP-1 巨噬细胞p-P38 和 IL-1β水平显著降低（P＜0.05）;与 SB203580 组比较，SB203580+BRPS组THP-1巨噬细胞p-P38蛋白水平显著降低（P＜0.05）。LPS处理后U0126组、BRPS组、U0126+BRPS组THP-1巨噬细胞p-ERK和IL-1β水平显著降低（P＜0.05）;与U0126组比较，U0126+BRPS组THP-1细胞p-ERK及IL-1β水平显著降低（P＜0.05）。LPS 处理后 SP600125 组、BRPS 组、SP600125+BRPS 组 THP-1巨噬细胞p-JNK和IL-1β水平显著降低（P＜0.05）;与SP600125组比较，SP600125+BRPS 组THP-1 巨噬细胞 p-JNK 水平显著降低（P＜0.05）。8、Western blotting检测结果显示,LPS处理后THP-1巨噬细胞p-NF-κB蛋白表达水平升高（P＜0.05）;BRPS预处理后THP-1巨噬细胞p-NF-κB蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。采用NF-κB通路抑制剂BAY11-7082进行验证，LPS处理后BAY11-7082 组、BRPS 组和 BAY11-7082+BRPS 组 THP-1 巨噬细胞 p-NF-κB 及IL-1β蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）;与 BAY11-7082 比较，BAY11-7082+BRPS组THP-1巨噬细胞p-NF-κB及IL-1β蛋白水平显著降低（P＜0.05）。 结论:BRPS抑制LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎症反应，其机制与MAPK、NF-κB信号通路有关。
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