摘要
犊牛腹泻是临床常见疾病，具有发病率高、死亡率高等特点，严重影响犊牛生长和存活，对养牛业发展造成较大威胁。细菌性感染是犊牛腹泻的主要病因之一，而大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）是最主要的病原菌。当前，细菌耐药性和药物残留问题日益凸显，噬菌体因安全性高、杀菌性能强和来源广泛等优势被科学家们认为是最具潜力的替抗微生态制剂。水牛是我国南方重要的特色经济动物，提供了丰富的肉、奶原料，但水牛犊大肠杆菌性腹泻的研究较少，缺乏诊疗数据支持。因此对广西地区水牛犊大肠杆菌性腹泻进行流行病学调查，评估噬菌体疗法替代抗生素疗法的可行性，对预防和控制水牛犊大肠杆菌性腹泻具有重要意义。主要研究内容及结果如下： 1.致水牛犊腹泻大肠杆菌的分离及生物学特性研究 采集广西地区腹泻水牛犊肛拭子185份，通过选择性培养基、形态学观察、生化鉴定，共分离到141株E.coli。通过致泻性大肠杆菌（Diarrheogenic Escherichia coli,DEC）毒力基因鉴定、DEC生化鉴定和16S rRNA鉴定，判定其中23株为DEC。随后，通过药敏试验和大蜡螟幼虫毒力试验，发现氨苄西林耐药率为95.65%，土霉素耐药率为65.22%，并获得2株高毒力株，7株中毒力株。筛选得到1株6重耐药、高毒力产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,SETC），命名为STEC_ZZ-2，经全基因组测序分析，发现其携带多种毒力与耐药基因，具有跨宿主感染能力。 2.大肠杆菌噬菌体的分离及生物学特性分析 采集污水样本56份，以STEC_ZZ-2为宿主菌，通过双层琼脂平板法分离到2株裂解性噬菌体，命名为vB_EcoM-LTH01和vB_EcoM-LTH02。通过宿主谱测定、温度稳定性试验、pH稳定性试验、最佳感染复数（Multiplicity of infection，MOI）测定和一步生长曲线测定评价噬菌体生物学特性。结果显示：vB_EcoM-LTH01可裂解9株E.coli；在pH值3~11、4℃~50℃的条件下保持良好活性；最佳MOI为0.001，潜伏期20min，爆发量72PFU/cell。噬菌体vB_EcoM-LTH02可裂解11株E.coli；在pH值5~7、4℃~60℃条件下保持良好活性；最佳MOI为0.01，潜伏期10min，爆发量124PFU/cell。通过透射电镜观察和全基因组测序分析，发现vB_EcoM-LTH01为Vequintavirinae亚科噬菌体，vB_EcoM-LTH02为Felixounavirus属噬菌体。2株噬菌体均不携带毒力基因、耐药基因及溶源基因。 3.噬菌体鸡尾酒对腹泻小鼠的治疗效果研究 为了诱导小鼠腹泻，采用不同的方法：单次灌服STEC、单次2%NaHCO3预处理后灌服STEC、多次2%NaHCO3预处理后灌服STEC及腹腔注射STEC。通过观察小鼠临床表现，记录腹泻率和死亡率，最终确定腹腔注射10mL/kg，1×109CFU/mL剂量的STEC_ZZ-2能成功诱导小鼠腹泻。将60只昆明小鼠随机分为6组（PBS对照组、氨苄西林组、噬菌体鸡尾酒组、腹泻对照组、氨苄西林治疗组及噬菌体鸡尾酒治疗组）。通过血常规指标测定、结肠病理组织学观察、结肠炎症因子、紧密连接蛋白和黏蛋白基因水平检测，探究噬菌体鸡尾酒对腹泻小鼠的治疗效果。结果显示：与腹泻对照组相比，噬菌体鸡尾酒治疗降低了小鼠中性粒细胞百分比、红细胞压积和血红蛋白含量，有效抑制结肠黏膜上皮脱落、炎性细胞浸润，逆转隐窝排列不齐、扭曲和萎缩；此外，噬菌体鸡尾酒治疗组小鼠结肠炎症因子（TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-18）和紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1、和Claudin-1）基因表达量降低，黏蛋白（Mucin-1和Mucin-2）基因表达量升高，与氨苄西林治疗相比，疗效相当。 综上所述，结论如下： 1.广西地区致水牛犊腹泻大肠杆菌流行率高，耐药情况严重。 2.噬菌体vB_EcoM-LTH01和vB_EcoM-LTH02是具有优良生物学特性的广谱裂解性噬菌体，不携带毒力基因、耐药基因及溶源基因。 3.以vB_EcoM-LTH01和vB_EcoM-LTH02组成的噬菌体鸡尾酒有效缓解腹泻小鼠结肠炎症，恢复肠道机械屏障和化学屏障功能。
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