摘要
本文从以下几部分进行论述： 第一部分:CUDC101对体外Lewis肺癌细胞在增殖、凋亡、迁移和侵袭方面的作用 目的: 评估CUDC101对体外Lewis肺癌细胞在增殖、凋亡、迁移和侵袭方面的作用与影响。 方法: 使用细胞增殖-毒性实验探究不同浓度CUDC101在24小时和48小时抑制体外Lewis肺癌细胞的增殖效果;使用流式Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测分析不同浓度CUDC101处理48小时后Lewis肺癌细胞凋亡情况;使用细胞划痕实验评估CUDC101对Lewis肺癌细胞的平行运动能力的影响;使用Transwell迁移和侵袭实验评估CUDC101对Lewis肺癌细胞的迁移和侵袭能力影响。 结果: 1、细胞增殖-毒性实验和显示:CUDC101以7.5、5、2.5、0.5、0.1ug/ml浓度体外作用于Lewis肺癌细胞时，24小时Lewis肺癌细胞的增殖率分别为19.80±3.30％、27.38±11.91％、37.29±10.05％、94.16±10.68％、97.06±10.91％;48 小时增殖率分别为12.06±1.83％、11.92±1.97％、12.57±2.72％、43.77±5.46％、66.62±10.27％。 2、流式 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡实验显示:CUDC101 以 7.5、5、2.5、0.5、0.1、0ug/ml浓度体外作用于Lewis肺癌细胞时，48小时凋亡率分别为94.10％、83.80％、46.00％、26.10％、9.56％、0.56％。 3、细胞划痕实验结果显示:在使用浓度为2.5ug/ml CUDC101处理Lewis肺癌细胞24小时后，2.5ug/ml CUDC101组24小时细胞迁移率为6.32±3.29％，对照组为20.56±7.20％，两者存在统计学差异（p=0.036）。 4、细胞迁移实验结果显示:2.5ug/ml CUDC101处理组24小时Lewis肺癌细胞穿越Transwell小室的细胞数量为1338.50±174.70个，少于对照组1608.25±74.65个，两者具有统计学差异（p=0.0296）。 结论: CUDC101可以以浓度和时间依赖的方式，在体外抑制Lewis肺癌细胞的增殖，促进Lewis肺癌细胞的凋亡。同时CUDC101还可以抑制Lewis肺癌细胞的横向、纵向迁移以及侵袭能力。 第二部分:CUDC101对小鼠皮下Lewis肿瘤的抑制作用与安全性评价分析 目的: 评估不同剂量条件下CUDC101对小鼠皮下Lewis肿瘤抑制作用的剂量疗效关系和潜在副作用;评估不同剂量条件下CUDC101的对小鼠抗肿瘤免疫的调节作用。 方法: 选取16只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组，分别为对照组、CUDC101 30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg组，每组4只。在小鼠背部接种等量Lewis肺癌细胞的细胞悬液，建立小鼠肺腺癌皮下肿瘤模型。给药方案为除对照组外其余3组按照CUDC101为30/60/120mg/kg/只剂量给药，每天腹腔注射给药1次。每2天测量一次肿瘤体积和小鼠体重并记录绘制成曲线。在实验终点时处死小鼠，剥离并称取肿瘤质量;收集小鼠心，肺、肝、肾等组织进行HE染色以评估药物安全性;使用免疫组化染色评估肿瘤组织Ki67表达情况;使用流式细胞术评估小鼠脾脏T细胞群百分比变化和CD8+T细胞IFN-γ分泌情况。 结果: 1、肿瘤质量:对照组、CUDC101 30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg组的肿瘤质量分别为 0.49±0.17g、0.32±0.15g、0.20±0.12g、0.16±0.09g;与对照组比较，CUDC101 60mg/kg和120mg/kg组Lewis肿瘤质量均显著减少，其差异具有统计学意义（p=0.0482，p=0.0238）。 2、肿瘤体积:在实验第 11、13、15、17 天时，CUDC101 60mg/kg、120mg/kg 组与对照组相比，肿瘤体积均减少，具有统计学差异（p＜0.05）;而CUDC101 30mg/kg组，仅在实验第11、13天时肿瘤体积与对照组之间存在统计学差异（p=0.0092,p=0.0119）。至第17天时，两者肿瘤体积无明显差异（p＞0.05）。 3、小鼠体重:在实验第 9、11、13、15、17 天时，CUDC101 60mg/kg 和 120mg/kg组与对照组相比，两组小鼠体重均出现不同程度的下降，具有统计学差异（p＜0.05）。在实验第11和第13天时，CUDC101 30mg/kg组小鼠体重出现短暂的下降，与对照组相比具有统计学差异（p＜0.0001），但在实验用药开始（第7天）和结束（第17天）时，CUDC101 30mg/kg组与对照组小鼠体重相比，两者统计学差异均不明显（p＞0.05）。 4、免疫组化Ki67染色结果显示:对照组、CUDC101 30、60、120mg/kg组肿瘤组织切片的 Ki67 的染色面积分别为 28.37±1.47％、26.17±1.89％、24.45±0.75％、23.19±1.50％。其中30mg/kg组与对照组相比无统计学差异（p＞0.05）;60mg/kg、120mg/kg组与对照组相比有统计学差异（p=0.0418,p=0.0064）。HE染色结果显示，CUDC101在60mg/kg/day的剂量下，小鼠主要器官无明显毒副作用影响，小鼠心,肺、肝、肾等组织形态学方面与对照组无明显差异。 结论: 1、中高剂量CUDC101可以有效抑制免疫功能完全的小鼠皮下Lewis肿瘤的生长和增殖。CUDC101的副作用为体重减轻。 2、CUDC101具有一定的免疫调节作用，可以增强小鼠脾脏组织CD8+T细胞的IFN-γ的分泌，从而增强CD8+T细胞介导的细胞毒性。 3、在单独使用CUDC101治疗时，60mg/kg/day的剂量在荷瘤小鼠体内产生的抗肿瘤效果较好，可以同时有效发挥其抗肿瘤和免疫调节作用。 第三部分:CUDC101联合顺铂疗法对小鼠皮下Lewis肿瘤的抑制作用的评估 目的: 探究CUDC101联合顺铂疗法在小鼠皮下肿瘤模型中对Lewis肿瘤生长抑制效果并初步评估其内在机制。 方法: 选取20只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组，分别为对照组，顺铂组，CUDC101组，CUDC101+顺铂联合治疗组，每组5只。在小鼠背部接种等量Lewis肺癌细胞的细胞悬液，建立小鼠肺腺癌皮下肿瘤模型。给药方案为CUDC101+顺铂联合治疗组按照CUDC101 60mg/kg/只剂量，每天腹腔给药1次;顺铂每3天按照3mg/kg/只剂量腹腔给药1次，顺铂与CUDC101同时给药当天，两药给药时间间隔为2h以上。顺铂组按照3mg/kg/只剂量腹腔给药，每3天给药1次;CUDC101组按照60mg/kg/只剂量给药，每天腹腔注射给药1次。每2天测量肿瘤体积和小鼠体重并记录绘制变化曲线。实验终点时处死小鼠，剥离并称取肿瘤质量;使用免疫组化Ki67染色和TUNEL免疫荧光染色评估各组肿瘤组织增殖和凋亡情况;使用Western Blot实验评估各组肿瘤组织细胞凋亡相关通路Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表达情况;评估PI3K/Akt和Erk信号通路蛋白及磷酸化蛋白的表达情况。 结果: 1、肿瘤质量:对照组，顺铂组，CUDC101组以及CUDC101+顺铂联合治疗组的肿瘤质量分别为 3.013±0.674g、1.307±0.604g、1.538±0.323g、0.371±0.193g;与对照组比较，顺铂组、CUDC101组以及CUDC101+顺铂联合治疗组肿瘤质量均显著减少，其差异均具有统计学意义（p＜0.001）;顺铂组与CUDC101组两组之间肿瘤质量无明显统计学差异（p=0.878）;与顺铂组和CUDC101组相比，CUDC101+顺铂联合治疗组在肿瘤质量上减少更加明显，与两组比较均具有统计学差异（p=0.037,p=0.008）。 2、肿瘤体积:CUDC101+顺铂联合治疗组在实验第11，13,15天时在肿瘤体积上显著小于其他组，与其他组肿瘤体积均具有统计学差异（p＜0.05）;顺铂组和CUDC101组在实验第13，15天肿瘤体积小于PBS组，具有统计学差异（p＜0.05），而两者在实验第11，13,15天之间肿瘤体积均无明显统计学差异（p＞0.05）。 3、HE染色显示:CUDC101+顺铂联合治疗组肿瘤组织细胞形态不清，胞浆和细胞核呈淡染状态，镜下出现大面积核凝聚和斑片状坏死，相较于其他组更为明显。 结论: 1、CUDC101+顺铂联合疗法在小鼠皮下Lewis肿瘤模型中展现出良好的抗肿瘤活性，显著抑制了 Lewis肿瘤的生长。 2、CUDC101+顺铂联合疗法可以通过有效抑制Lewis肿瘤组织的PI3K/Akt和ERK信号通路的蛋白磷酸化水平，从而有效抑制肿瘤细胞的增殖和激活凋亡通路,进而发挥其抗肿瘤活性。
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