摘要
由艾美耳属引起的禽球虫病是一种严重的寄生虫病，对家禽业构成威胁。目前，其预防和治疗主要依赖于药物预防和活卵囊疫苗免疫，但广泛的田间耐药性的产生以及活疫苗的固有局限性促使开发更方便、安全、经济的新型疫苗的需求更加紧迫。 前期研究表明，球虫棒状体蛋白为可能的候选免疫保护蛋白。但球虫棒状体蛋白众多，目前仅有少量被鉴定。在本研究中，分别对三个柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白（Eten2b、Eten3和Eten6）进行了分子特征分析，发现它们均在子孢子阶段高表达。序列分析表明，这三个基因均有蛋白激酶结构域和八个保守基序。将这三个基因cDNA进行原核表达与纯化，成功获得了其重组蛋白，并分别利用该重组蛋白制备了多克隆抗体。利用间接免疫荧光染色观察显示，无论在胞内子孢子还是胞外子孢子，Eten3和Eten6蛋白均在胞浆中呈散在点状分布，与Eten5-A部分共定位；而Eten2b在胞外子孢子胞浆中呈少量点状分布。同时通过Western blot分析发现这三个重组蛋白均能被感染柔嫩艾美耳球虫的鸡血清识别；且相应的多克隆抗体也能识别柔嫩艾美耳球虫子孢子中相应蛋白，这表明这些蛋白具有良好的反应原性。 为了进一步了解Eten2b、Eten3和Eten6生物学作用和免疫保护效果，研究了重组蛋白rEten2b、rEten3和rEten6对子孢子入侵细胞的影响，结果表明多克隆抗体Anti-Eten3和Anti-Eten6显著降低了子孢子的入侵率。免疫保护试验结果显示rEten2b免疫组、rEten3免疫组和rEten6免疫组的平均体增重相较于对照组上升；同时盲肠病变计分和卵囊排出量相较于对照组显著降低；抗球虫指数分别为120、164和142。这些结果表明rEten3重组蛋白具有中等免疫保护作用，为可能的抗球虫免疫保护抗原。 此外，因当前已知的艾美耳球虫棒状体蛋白还十分有限。本研究尝试通过邻近生物素标记技术TurboID，以本实验室前期验证的棒状体蛋白Eten5-B为诱饵蛋白对柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白进行筛选。首先构建了Eten5-B-TurboID融合表达柔嫩艾美耳球虫虫株，利用间接免疫荧光染色发现Eten5-B位于球虫子孢子的尖端区域，和Eten5-A共定位。通过对体外培养的Eten5-B-TurboID虫株子孢子进行生物素标记后，利用链霉亲和素磁珠对邻近蛋白进行纯化，并通过质谱鉴定候选球虫棒状体蛋白。质谱鉴定结果显示，共捕获到35个独特蛋白，但这些多为跨膜蛋白和转运蛋白，需要进一步对其定位进行验证。 本研究首次对柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白Eten2b、Eten3和Eten6的免疫保护效果进行了评估，为柔嫩艾美耳球虫的亚单位疫苗研究提供了新的免疫保护性候选抗原；同时本研究首次利用邻近生物素标记技术对球虫棒状体蛋白进行了鉴定，为球虫未知细胞器蛋白的鉴定提供了新的有力工具。
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