摘要
硒是与人体健康密不可分的必需微量元素，中国大部分地区处于缺硒状态。补充无机硒的安全限度非常小，有机纳米硒因其毒性小、生物利用度高有着广泛的应用前景。微生物特别是益生菌，合成有机纳米硒生产流程简单、绿色安全。但是亚硒酸钠对微生物有生物毒性，导致目前利用微生物合成有机纳米硒转化率和产率低，成本高，难以推广应用。本研究选择一株产胞外聚合物的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis）CGMCC 2876为研究对象，对其还原亚硒酸钠合成有机纳米硒的代谢过程进行研究，并通过实验室自适应进化选育亚硒酸钠耐受度高、有机纳米硒产量高的菌株，以降低有机纳米硒的生产成本，促进其推广应用。主要研究结果如下: （1）产胞外聚合物地衣芽孢杆菌还原亚硒酸钠表征 通过发现产胞外聚合物B.licheniformis 2876在含亚硒酸钠培养基中生长会变为红色，判断其具有还原亚硒酸钠合成纳米硒的能力。然后，进一步分析了菌株对亚硒酸钠的耐受度以及最佳还原条件，并对有机纳米硒和胞外聚合物进行表征。B.licheniformis 2876最佳亚硒酸钠还原条件为在培养前加入500 mg/L的亚硒酸钠、pH 7,24 h对亚硒酸钠的还原率为94％,纳米硒的产量97.48 mg/L,且菌体硒含量高达86.039 mg/g。B.licheniformis 2876产生的有机纳米硒分布于细胞内和细胞外，为球状颗粒，粒径约为175-275 nm。有机纳米硒合成过程中会分泌更多的胞外聚合物，且导致胞外聚合物组分变化以适应亚硒酸钠胁迫。 （2）产胞外聚合物地衣芽孢杆菌还原亚硒酸钠合成有机纳米硒机制解析 通过分离细胞不同亚组分以及生化分析，发现细胞内液、细胞膜及无细胞培养液在电子供体的参与下都具有亚硒酸钠还原能力，细胞膜在没有电子供体的参与下也具有还原能力。此外，菌株硝酸盐代谢途径和硫酸盐代谢途径参与了亚硒酸钠还原，并且硝酸盐代谢途径对亚硒酸钠的还原强于硫酸盐代谢途径。通过转录组分析，共有1927个基因显著变化，富集到7个显著的代谢通路。基于此推测B.licheniformis 2876还原亚硒酸钠合成纳米硒机制为:（a）在细胞外,亚硒酸钠被外泌的蛋白或者酶还原为纳米硒，也可能被EPS吸附，经过胞外电子传递过程作为电子受体被还原纳米硒。（b）亚硒酸钠通过硫酸盐转运蛋白、硝酸盐转运蛋白及其他途径转运至细胞内，在细胞膜上一部分亚硒酸钠通过酶促反应被还原为纳米硒，一部分通过杆菌肽等低分子硫醇介导的解毒过程还原为纳米硒。在细胞内可被硫酸盐还原酶、富马酸还原酶等还原为纳米硒，。 （3）实验室自适应进化提高地衣芽孢杆菌合成有机纳米硒能力 通过实验室自适应进化手段，对B.licheniformis 2876定向驯化120天，得到的菌株ALE 300对亚硒酸钠的耐受度从400 mM提升到700 mM,对于1000 mg/L和3000 mg/L亚硒酸钠的还原率分别提升113.4％和60.4％。菌株ALE 300在1 L发酵罐中对500 mg/L亚硒酸钠的还原24 h,菌体中硒含量为135.1 mg/g，纳米硒产量为 211.97 mg/L,较 B.licheniformis 2876 分别提升 57.0％和 217.5％。通过基因测序，在ALE 300中发现14个突变位点，主要涉及菌株的生长发育、合成代谢及膜转运，这些生物功能的变化可能导致菌株耐受高浓度的亚硒酸钠并提升对其还原效率。 综上所述，本论文以益生产胞外聚合物地衣芽孢杆菌CGMCC 2876实现将亚硒酸钠还原为纳米硒。通过生化分析及转录组学，解析了该菌株在胞外聚合物参与下还原亚硒酸钠合成有机纳米硒分子机制。最后，通过实验室自适应进化增强了菌株对亚硒酸钠的耐受及利用效率，提高了有机纳米硒含量，为有机纳米硒的绿色、安全环保及低成本工业化生产提供了菌株和应用基础。
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