摘要
背景和目的： 食管癌是全球最常见的癌症类型之一，其主要组织学类型分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌，我国的食管癌亚型以ESCC为主，占病例总数的90％以上。由于ESCC患者早期无明显症状且缺乏早期诊断的特异性标志物，超过50％的患者确诊时已处于中晚期，治疗效果不佳。目前放疗、化疗及手术等是ESCC主要治疗方式，放疗抵抗是导致食管癌患者临床疗效达不到预期效果的主要原因之一。因此，探索新的有效的治疗靶点，对于改善患者预后，提高生存率具有重要的意义。 POLO样蛋白激酶1(Polo-like Kinas 1，PLK1)在多种肿瘤中表达水平均高于周边正常组织，它与DNA损伤修复、细胞周期、上皮细胞间质转化等作用有关。因此，我们推测PLK1是ESCC放疗(Radiation)敏感性相关的一个非常有潜力的靶点。PD-L1/PD-1通路是肿瘤微环境(Tumormicroenvironment，TME)免疫抑制的主要通路。目前，包括抗体和小分子药物在内的多种策略可以抑制PD-L1/PD-1信号通路，但是此类药物仅能阻断二者的相互作用，并不能降解这些蛋白。因此，系统研究PD-L1的表达调控机制，有助于开发新的靶向药物，这对于肿瘤治疗尤为重要。PLK1高表达与抗肿瘤免疫之间存在负相关性，ESCC中PLK1是否调控PD-L1及其调控的具体分子机制尚不清楚，需要进一步深入研究。 本课题拟从组织、细胞、分子、动物模型等层面研究ESCC放疗过程中PLK1与放疗抵抗的关系和PLK1抑制促进PD-L1表达水平的具体作用和分子机制，本研究将为PLK1抑制联合放疗和抗PD-L1(anti-PD-L1)治疗ESCC这种新型综合治疗方案的探索及其临床转化提供理论基础，并为ESCC放疗联合免疫综合治疗方案的选择提供新的思路。 方法： 1.应用 GEPIA 数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/)和课题组 121 例 RNA测序数据，结合western blot方法，判断ESCC患者癌和癌旁组织中PLK1蛋白和mRNA水平。 2.构建体外培养KYSE150和KYSE450细胞放疗模型，过表达和下敲PLK1，通过细胞活力检测、克隆形成、免疫荧光等实验，观察PLK1对ESCC细胞放疗敏感性的影响。 3.构建体外培养KYSE150和KYSE450细胞放疗模型，western blot方法检测PLK1蛋白水平，通过免疫荧光实验，观察ESCC细胞DNA损伤情况，明确放疗过程中PLK1对ESCC细胞DNA损伤反应的影响;构建小鼠来源ESCC细胞皮下成瘤放疗模型，证实PLK1抑制的放疗增敏作用。 4.体外培养KYSE150和KYSE450细胞，western blot和流式细胞术实验，观察PLK1对PD-L1蛋白水平的影响，并探讨其潜在分子机制。构建体外培养KYSE150和KYSE450细胞放疗模型，观察PLK1抑制联合放射治疗对PD-L1的调控作用。 5.构建小鼠来源ESCC细胞皮下成瘤放疗模型，明确PLK1抑制剂、放疗联合抗PD-L1免疫治疗ESCC的效果。 6.应用ESCC患者肿瘤组织样本，通过免疫组织化学方法，明确PLK1与PD-L1蛋白水平的相关性。 结果： 1.测序数据分析结果和western blot结果显示，与癌旁组织相比较，ESCC癌组织中PLK1蛋白和mRNA水平显著升高。 2.CCK8实验、平板克隆形成实验和免疫荧光实验结果表明，与对照组相比较，ESCC细胞经放射治疗后PLK1过表达组细胞增殖能力显著增强，细胞存活分数显著升高，而PLK1下敲组细胞增殖能力显著降低，细胞存活分数显著下降。 3.免疫荧光和western blot实验结果表明，随着放疗时间的延长，ESCC细胞中PLK1蛋白水平逐渐升高，DNA双链断裂标志物γ-H2AX蛋白和细胞核中γ-H2AX foci逐渐减少;随着放疗剂量的增加，ESCC细胞中PLK1蛋白水平逐渐升高。与对照组相比较，ESCC细胞放疗过程中，PLK1过表达组细胞核中γ-H2AX foci减少，PLK1下敲组细胞核γ-H2AX foci增加。 4.流式细胞术和western blot实验结果表明，与对照组细胞相比较，PLK1下敲组ESCC细胞膜PD-L1蛋白水平显著升高;PLK1抑制联合放疗显著上调细胞膜PD-L1蛋白水平。PLK1抑制剂或下敲PLK1增加NF-κB核转位，促进NF-κB蛋白磷酸化，上调PD-L1蛋白水平，NF-κB核转位抑制剂能逆转该现象。 5.小鼠来源ESCC细胞皮下成瘤放疗模型结果显示，PLK1抑制、放疗联合抗PD-L1免疫治疗具有协同抗ESCC的作用。 6.ESCC患者肿瘤组织样本免疫组织化学结果表明，PLK1与PD-L1蛋白水平显著负相关。 结论： 1.PLK1介导ESCC放疗抵抗，抑制PLK1显著增强ESCC放疗敏感性。 2.PLK1抑制能够促进NF-κB核转位，上调ESCC细胞膜PD-L1蛋白水平。 3.PLK1抑制、放疗联合抗PD-L1免疫治疗具有协同抗ESCC作用。
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