摘要
研究背景: 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。传统治疗方法，如手术、放疗、化疗、内分泌治疗等，对正常组织伤害大，毒副作用强，并且在药物治疗过程中往往伴随肿瘤细胞的非特异性普遍耐药，导致治疗效果下降。声动力疗法（ SDT）利用超声激活声活性物质——声敏剂，产生活性氧和空化效应，能够诱导细胞凋亡和坏死,从而杀灭肿瘤细胞。由于超声可以聚集到体内的小范围组织中，有潜在的定位治疗能力，因此SDT是一种无创、精准、安全、高效、可重复性的治疗手段。 HMME是第二代血卟啉（HP）声敏剂，具有成分单一、性能稳定、肿瘤选择性高的优点，可通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，在临床上得到广泛应用。然而传统声敏剂存在生物相容性差、易降解、活性氧（ROS）产量低等问题，制约了 SDT效能。研究者们通过纳米技术，尝试利用纳米载体提高声敏剂的疗效。纳米材料具有粒径小、比表面积大等特点，可高效运载小分子药物至肿瘤内部。它们具有稳定性高、粒径可调、负载容量大、可结合亲、疏水物质等优势，因此在肿瘤研究中备受关注。由于肿瘤间质致密、血管通透性差，当前基于EPR效应的纳米药物主要聚集在肿瘤血管周围，导致被动肿瘤穿透效率低。低频超声辐照可通过“空化效应”产生微射流和微冲力，明显增加肿瘤血管通透性，使药物更容易渗入肿瘤间质和细胞内。与正常组织不同，肿瘤微环境（ TME）呈乏氧、偏酸、富含H2O2和谷胱甘肽（GSH）的特性。乏氧环境限制了 SDT对肿瘤的治疗效能，而SDT过程中氧气的消耗加重肿瘤的增长和转移。因此，合成具有TME调控能力的纳米药物递送系统成为当前SDT研究的热点之一。 在这里，开发了 pH响应的TME调控型纳米药物递送系统——中空介孔二氧化锰（H-MnO2）,同时高效负载化疗药物和声敏剂后，通过氢键连接上亲水性牛血清白蛋白（BSA）,对H-MnO2进行表面修饰，使纳米载体在体内循环过程中维持稳定的结构，降低聚集趋势，提高水溶性和分散稳定性。 而且，BSA通过白蛋白受体（Gp60）介导的转运还可以增加肿瘤内的药物积聚。H-MnO2在肿瘤弱酸环境下降解并释放药物，最大限度地减少药物在正常生理条件下的过早泄漏;H-MnO2还能通过催化分解TME中富含的H2O2,在病灶原位产生氧气以缓解TME乏氧状态，进而增强SDT协同化疗的疗效。同时H-MnO2在酸性环境下分解后的Mn2+，能与H2O2发生类芬顿（Fenton）反应，从而产生羟基自由基（· OH），发挥化学动力疗法作用。研究表明，H-MnO2还能将TME中高表达的GSH转变为GSH硫化物，以此减少GSH对·OH的清除作用并消除高水平的GSH的其它潜在不良影响。因此，H-MnO2具有与TME高度匹配的化学特性，高效载药并修饰后，能够实现TME依赖的药物控释以及肿瘤的精准联合治疗，这为研发多功能纳米药物递送系统治疗乳腺癌提供了理论支持。 研究目的: 1）合成中空介孔二氧化锰H-MnO2,检测其作为理想的纳米载体所需的各项性能。 2）制备DH-HM@BSA载药多功能纳米粒，检测其体内外抗肿瘤效果。 3）探索DH-HM@BSA多功能载药纳米粒用于肿瘤治疗的潜在机理。 研究方法: 1）合成HM纳米壳并进行TEM、SEM、粒径与电位表征;制备DH-HM@BSA多功能纳米粒并进行紫外-可见光谱、粒径与电位表征;测定负载药物的包封率与载药量，进行载体降解与释药研究，并检测H-HM@BSA多功能纳米粒的1O2生成能力。 2）以MCF-7乳腺癌细胞为模型，通过细胞毒性实验、摄取实验、ROS检测、Calcein-AM/PI活/死双染实验以及CCK-8实验，研究HM纳米壳和多功能载药纳米粒的细胞行为和体外抗肿瘤效果。 3）以4T1荷瘤裸小鼠为模型，通过活体荧光成像系统观察体内药物分布，通过肿瘤体积监测、组织病理学检查监测抑瘤效果，通过对重要组织的血液学及病理学检查评估基于DH-HM@BSA多功能纳米粒体内治疗的生物安全性。 4）通过对肿瘤组织的HIF- 1α、DHE免疫荧光染色，以及Capase-3、TUNEL、PCNA等免疫组织化学染色，评估肿瘤组织的坏死、凋亡、增殖情况，并对肿瘤组织的缺氧以及活性氧产生情况判定，以探索DH-HM@BSA多功能载药纳米粒用于肿瘤治疗的潜在机理。 研究结果: 1）成功制备得到多功能纳米粒并进行表征。结果表明制备HM尺寸较小，分散性较好，并表现出过氧化氢酶特性;紫外-可见光谱、粒径电位监测等表明，制备的载药多功能纳米粒具有高的载药量和包载率，经超声辐照具有优异的1O2产生能力，在肿瘤酸性环境中载体HM可以降解并释放药物，联合超声辐照后，能高效释药。 2） H-MnO2对MCF-7乳腺癌细胞没有明显的细胞毒性;MCF-7细胞摄取DH-HM@BSA后，4h药物可以完全进入肿瘤细胞核;H-HM@BSA多功能载药纳米粒在细胞水平用于SDT的最佳超声功率为0.5 W/cm2,该条件下产生ROS能力最强;DH-HM@BSA多功能载药纳米粒联合超声辐照可以实现增强的化学-SDT联合治疗效果。 3） DH-HM@BSA多功能载药纳米粒注射后8h在肿瘤部位的浓度达到最大值，24 h时浓度仍较高，表现出良好的肿瘤靶向性和滞留能力;DH-HM@BSA多功能纳米粒联合超声治疗组抑瘤效果最显著，发挥了增强的化学-SDT效果，同时对其他主要生理器官没有明显的损伤，表现出良好的生物相容性和安全性，HIF-1α的表达明显降低，说明有效改善了肿瘤缺氧的微环境。 研究结论: 综上，在本研究中，我们制备了 PH响应型中空介孔MnO2 （H-MnO2）纳米载体，高效负载HMME和DOX，经简单的BSA修饰后，表现出优异的亲水性和分散性，提高了化疗药和声敏剂的循环稳定性和肿瘤部位的归巢性，增强了 EPR效应，最大限度地减少药物的过早泄漏。由于MnO2具有与TME高度匹配的化学活性，有效改善了肿瘤的乏氧状态，增强SDT疗效，促进了乳腺肿瘤细胞的凋亡。DH-HMD@BSA+US的联合治疗策略降低了化疗药物的全身毒副作用，逆转化疗耐药，实现了准确的肿瘤靶向能力，最终导致荷瘤小鼠肿瘤生长抑制提高并且无明显不良反应。这种基于H-MnO2的纳米递送系统是一种简洁、高效、安全的多功能融为一体的纳米治疗平台，本研究为下一步改善肿瘤免疫微环境和抗肿瘤耐药治疗提供了一种有前景的策略，并显示出巨大临床应用潜力。
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