摘要
意大利青霉菌(Penicillium italicum)引起的柑橘青霉病是柑橘采后最严重的病害之一。甾醇合成脱甲基抑制剂(DMI)类杀菌剂咪鲜胺对柑橘采后病害防效显著，但长期大量地使用导致意大利青霉菌对咪鲜胺产生了抗药性。聚集突变(Cluster mutation)是指在一段基因序列上发生连锁的多个间隔较小的突变。本课题组前期研究发现在意大利青霉菌咪鲜胺抗性菌株的DMI靶标基因PiCYP51A/B发生了聚集突变。基于此，本论文进一步研究了意大利青霉菌田间抗性菌株聚集突变的基因型、各基因型的频率、生物学特性并探究了聚集突变的分子机制，主要结果如下: 1.2021和2022年从七个柑橘主要产区采集分离到294株意大利青霉菌，通过区分剂量0.1μg/mL和有效中浓度(EC50)来监测对咪鲜胺的抗性，16株敏感菌株EC50值范围为0.0083-0.0176μg/mL,平均EC50值为0.0134μg/mL±0.0028(SD)，根据前期敏感性基线的研究，将EC50＞0.1μg/mL的菌株划分为咪鲜胺抗性菌株，意大利青霉菌抗性频率为23.81％,70株抗性菌株平均EC50值为2.3797μg/mL±1.7030(SD)，EC50值范围为0.6087-8.7586μg/mL,抗性倍数范围为45.4-653.6倍。 2.通过比对意大利青霉菌敏感菌株与抗性菌株靶标基因PiCYP51A/B的碱基序列，在抗性菌株基因PiCYP51A上发现三种聚集突变基因型，其中有30处核苷酸突变的为AR1型，在AR1型基础上增加3处点突变的为AR2型，在AR2型基础上增加2处点突变的为AR3型，AR1、AR2和AR3三种基因型在抗性菌株中的发生频率依次为30.99％、14.08％和54.93％;在基因PiCYP51B上发现两种聚集突变基因型，其中有17处核苷酸突变的为BR1型，在BR1型基础上增加2处点突变的为BR2型，这两种基因型发生频率分别为64.79％和35.21％。在抗性菌株中，基因PiCYP51A和PiCYP51B有六种聚集突变基因型，其中，AR3+BR1型和AR1+BR2型菌株的发生频率相对较高，分别为53.52％和23.94％,其余各基因型菌株的发生频率均较低。通过双因素方差分析表明PiCYP51A突变基因型(P=0.006)、PiCYP51B突变基因型(P＜0.001)及其交互效应(P=0.022)均显著影响意大利青霉菌的抗性水平，且意大利青霉菌PiCYP51A和PiCYP51B聚集突变基因型的突变越多，菌株抗性水平越高。 3.五种聚集突变组合(因AR3+BR2型只有一株除外)菌株与敏感菌株相比在菌丝生长量和致病力方面无显著差异，在孢子产量、果实上的产孢大小以及竞争力方面存在显著差异，其中AR2+BR1型菌株在这三个方面显著低于其余各基因型菌株(P＜0.05)，这可能是导致该基因型菌株发生频率(4.23％)较低的原因，而AR3+BR1型菌株在果实上的产孢直径显著高于敏感菌株、AR2+BR1型和AR2+BR2型菌株(P＜0.01)，在竞争力方面显著高于AR1+BR1型和AR2+BR1型菌株(P＜0.001)，这可能是导致该基因型菌株发生频率较高的原因。不同聚集突变基因型菌株对渗透压的适应能力不同，但均显著高于敏感菌株，对H2O2的耐受性低于敏感菌株。 4.与各自未处理的对照相比，用药和诱变剂分别处理后，敏感菌株的H2O2含量与O2-含量都显著升高，AR3型菌株在用药处理后O2-含量显著升高(P=0.001)，而其余突变基因型菌株的H2O2含量与O2-含量皆无显著变化，表明敏感菌株氧化应激能力强于发生聚集突变的菌株，更容易积累活性氧，导致DNA损伤。在用药处理后，意大利青霉菌敏感菌株和不同聚集突变基因型菌株的跨损伤DNA合成(TLS)聚合酶相关基因pol Rev1和pol Zeta的表达量相较于未处理无显著差异，不同基因型之间也无显著差异(P＞0.05)，这表明意大利青霉菌聚集突变的发生与基因pol Rev1和pol Zeta的表达无关。 综上，本论文的研究对深入理解意大利青霉菌对DMI类杀菌剂抗性的分子机制及聚集突变对抗性的影响具有重要的理论意义。
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