摘要
免疫检测在辅助诊断、复查、治疗跟踪及评估疗效方面发挥着关键作用，可以提供关于疾病进程、风险评估和治疗响应的重要信息。酶联免疫吸附方法因其具有高灵敏度和特异性被广泛应用于免疫检测中，但同时检测多个生物标志物时由于操作步骤繁琐、反应时间长以及对样品量的较大需求，会大大降低检测效率。鉴于此，开发一种能同时检测多指标的快速、自动化、小型化免疫检测平台具有重要意义。本文旨在现有技术基础上，优化并构建一个可高效检测高浓度蛋白的自动化多重免疫检测平台，以提升免疫检测的整体效率。 在基于数字微流控平台的免疫检测中，试剂的顺利驱动是进行检测的前提，蛋白试剂在驱动中会产生更大的阻力，合适的疏水材料能够减少试剂驱动时的阻力，为保证检测的顺利进行，选择合适的疏水材料是关键。首先，通过比较各种疏水剂在玻片上成膜接触角的大小，选择了疏水性能最佳的FluoroPel作为疏水试剂。通过在ITO玻片上添加粘结层解决了制备抗体条形码过程中疏水层出现不同程度剥离的问题。为验证FluoroPel作为疏水试剂是否满足免疫检测的需求，分别以FITC-BSA、IL-8捕获抗体为模型蛋白固定在ITO玻片上，通过荧光扫描和原子力扫描对Fluoropel与蛋白结合的均匀性进行了表征。在荧光扫描图中随机选取400×10个区域，得到变异系数（CV）值为4.8％。原子力扫描结果表明，固定在玻片上的抗体的高度基本一致，粗造度为1 nm。结果表明FluoroPel作为疏水剂满足免疫检测的需求。 为实现该平台可连续、并行的快速检测，设计并优化电极芯片上用于分配液滴的电极图案。通过将两个方形输运电极改为两个近四分之一圆弧电极和两个半圆弧电极，构建了能够可靠分液的电极图案。在所使用的四种分液电极尺寸中，分液体积的CV值均低于3％,最低CV可达1.0％。为加快检测速度，针对免疫检测时间进行了优化，通过调整操作流程并采用恒温加热（37℃）的方法，将免疫检测反应时间从室温下的80 min缩短至20 min内。最后通过制定可设置、可存储、可调用、可追溯的多液滴操控协议，实现了在数字微流控平台上自动、快速的进行多样品平行免疫诊断。 最后利用本平台进行蛋白标准品的检测，绘制了其滴定曲线（最高拟合系数为99.3％），证明了本方法用于免疫检测的可行性。接着对U937、AC16、HUCCT1和HUVEC四种细胞的上清液进行五重免疫检测（包含IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-8）,通过荧光扫描结果图和荧光强度定量分析图，可以比较四种细胞中不同蛋白的表达水平。这些发现为进一步探索细胞因子在疾病进展中的作用提供了实验证据。此外，对人血清进行免疫检测，比较空白对照组和血清样本组，发现IL-8浓度高于正常水平，这与临床医院的检测结果一致。与过去的平台不同，该平台可以进行高浓度蛋白的血清样本分液、孵育和移除等操作，这为将来的血清检测提供了重要参考。 本实验成功构建了可对高浓度蛋白进行快速、自动的多重免疫检测平台，并且能够对实际样本进行检测，展示了其在不同类型样品中的广泛应用前景。
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