摘要
我们在日常饮食中经常会吃到各种植物性食物，比如水果、蔬菜、咖啡和茶等。这些食物中富含多种代谢产物，尤其是占比最高的黄酮类化合物，对人们健康有诸多益处。在柑橘类水果中，有一种结构特殊的黄酮类化合物叫做聚甲氧基黄酮，它们只存在于柑橘中，并且具有多种生物活性，因此受到广泛关注。同样地，绿茶中含有的儿茶素类化合物也属于黄酮类物质，具有显著的治疗潜力，对防治癌症和炎症等多种疾病有帮助。 植物性食物中的黄酮类化合物进入人体后很难被小肠吸收，大多直接进入大肠，与栖息在大肠的微生物群发生相互作用。一方面，肠道微生物群编码丰富多样的酶，能够催化类黄酮苷的生物转化，产生结构和生物活性各异的代谢物。另一方面，膳食黄酮及其代谢物能够影响肠道微生物群的组成和功能。因此，膳食黄酮类化合物与肠道微生物之间的相互作用对人类健康具有重要意义。肠道菌群代谢直接改变膳食中摄入的天然产物，使其在膳食营养中扮演重要角色,然而，关于具体的肠道菌株和酶的生物学功能报道还是非常缺乏的，极大限制了我们利用微生物学为人类健康提供有效帮助。 因此，本研究选择了柑橘类黄酮中的聚甲氧基黄酮(Polymethoxylated Flavones,PMFs)和绿茶多酚中的表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)作为研究对象。通过混菌厌氧共孵育和单菌落筛选，我们发现了能有效代谢PMFs和EGCG的菌株。同时对代谢菌株进行转录组测序分析，并通过异源表达、蛋白纯化及体外酶反应等手段对候选基因进行验证，探究代谢菌株中具体的代谢酶。这项工作将为理解肠道微生物如何代谢膳食来源的黄酮类化合物及其具体酶反应机制提供关键线索。研究主要结果如下: (1)肠道微生物群对柑橘类黄酮的代谢:聚甲氧基黄酮川陈皮素在健康成年人的粪便微生物群中厌氧孵育，通过LC-MS对其代谢进程进行检测。结果表明川陈皮素在共孵育的24小时内被大量代谢，生成了包括单去甲基川陈皮素和双去甲基川陈皮素在内的多种代谢产物。随后，通过单菌落筛选发现了对柑橘聚甲氧基黄酮具有去甲基化能力的单菌—Eubacterium limosum ATCC 8486。通过对底物孵育组和空白组的转录组对比分析以及BLAST分析，从粘液真杆菌(E.limosum)中发现了关键基因簇:B2M23_RS16845—B2M23_RS16870。这个基因簇编码钴胺素依赖的去甲基酶系统，可能是催化川陈皮素去甲基化反应的关键机制。 (2)肠道微生物群对绿茶儿茶素的代谢:表没食子儿茶素没食子酸酯在健康成年人的粪便微生物群中厌氧孵育，通过LC-MS对其代谢进程进行检测。结果表明EGCG和粪便微生物共同孵育3小时后开始水解，生成没食子酸(GA)和(-)-表没食子儿茶素(EGC),随后EGC又进一步降解成其他产物。通过单菌落筛选，我们发现了对EGCG具有水解能力的单菌——Klebsiella variicola subsp.variicola。通过对底物孵育组和空白组的转录组对比分析以及候选基因功能验证找到了 K.variicola subsp.variicola中的酯水解酶——GFC07_RS15890。最后，通过单菌落测试发现了对EGC具有还原和去羟基化等能力的单菌——Eggerthella lenta JCM9979以及一系列Eggerthella lenta野生型菌株。这些发现为理解EGCG在肠道微生物群中的复杂代谢途径提供了重要线索。 这些数据为肠道微生物代谢膳食来源的黄酮类化合物及其具体酶反应机制提供了更深入的理解。
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