摘要
牛结核病为人畜共患慢性传染病，以组织器官形成结核结节为特征。牛支原体可导致各个年龄阶段的牛发病。牛支原体病和牛结核病不仅影响养牛业健康发展，亦给公共卫生安全带来严峻挑战。牛支原体/牛结核分枝杆菌感染牛群长期带毒，常规防控措施效果不佳，因此定期、及时检测至关重要。胶体金免疫层析技术广泛应用于食品卫生、环境监测及生物医学等领域，与微生物学、分子生物学及免疫学等诊断技术相比，具有经济高效、不依赖专业技术人员和实验室大型仪器等优势。牛支原体病及牛结核病发病普遍，利用胶体金免疫层析技术同时检测省时省力，但市面上暂无同时检测牛支原体与牛结核抗体的胶体金试纸条。本研究以实验室早期制备的牛支原体rMbovP579蛋白及牛结核RCE蛋白（Rv3872、CFP-10和Esat-6融合蛋白）为基础，整合开发了牛支原体与牛结核抗体双重检测胶体金试纸条，并对检测效果进行验证。主要研究结果如下: 1.rMbovP579及RCE蛋白制备及鉴定 对表达纯化后的两种蛋白分别进行鉴定，SDS-PAGE结果显示，目的蛋白条带均大小正确且无其他杂蛋白;Western-blot实验结果表明，制备的rMbovP579蛋白及RCE蛋白均能与其对应的标准阳性血清反应，且不与标准阴性血清反应,免疫原性良好，符合后续建立检测方法的要求;BCA法测定蛋白浓度分别为4.13mg/mL及1.62mg/mL。 2.牛支原体抗体胶体金免疫层析试纸条的制备 柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，在522nm处有最大紫外吸收峰，对应粒径大小满足后续实验需求;方阵滴定实验确定最佳金标蛋白制备条件为1mL胶体金溶液中加入12μL0.1M K2CO3溶液及19.2μL1mg/mL r-SPG蛋白;根据试纸条显色确定金标蛋白重悬液配方为1％Tween-20、10％蔗糖、2.5％BSA、0.5％酪蛋白酸钠，pH6.0的0.01M PBS缓冲液，样品垫与结合垫封闭液配方为1％Tween-20、1.5％海藻糖、1.5％BSA、0.3％PVP-40,pH8.5的0.01M Tris-HCl缓冲液，NC膜为CN-140;确定金标蛋白重悬浓度为原体积1/10;梯度实验确定T线rMbovP579蛋白最佳包被浓度为1.5mg/mL;灵敏性试验中，最低可检测出15倍稀释的牛支原体标准阳性血清;试纸条与口蹄疫、布鲁氏菌病、传染性牛鼻气管炎、副结核、巴氏杆菌病无交叉反应且稳定性试验结果显色正常。 3.牛结核抗体胶体金免疫层析试纸条的制备 胶体金溶液制备结果及金标蛋白制备最佳条件同牛支原体抗体检测胶体金试纸条。确定金标蛋白重悬液配方为1％Tween-20、10％蔗糖、2.5％BSA,pH5.5的0.01M Tris-HCl缓冲液，垫材处理液配方为1％Tween-20、2％蔗糖、2％BSA、0.3％PVP-40,pH7.4的0.01M PBS缓冲液，NC膜型号为CN-140;金标蛋白重悬浓度为原体积的1/10;T线RCE蛋白最佳包被浓度为1.5mg/mL;灵敏性试验结果显示，试纸条最低能检测出20倍稀释的牛结核标准阳性血清;特异性试验结果显示与口蹄疫、布鲁氏菌病、传染性牛鼻气管炎、副结核、巴氏杆菌病无交叉反应;稳定性试验结果良好，试纸条显色正常。 4.牛支原体/结核抗体胶体金双重免疫层析试纸条的制备 在两个单联胶体金试纸条的基础上开发双联试纸条，胶体金溶液制备结果及金标蛋白制备最佳条件同牛支原体抗体检测胶体金试纸条。金标蛋白重悬液配方为1％Tween-20、15％蔗糖、2.5％BSA,pH5.5的Tris-HCl缓冲液，垫材处理液为1％Tween-20、2.5％蔗糖、2.5％BSA、0.9％NaCl,pH7.4的0.01M Tris-HCl缓冲液;金标蛋白重悬浓度确定为原体积的1/15;检测线T1包被1.5mg/mL的RCE蛋白，T2线包被2mg/mL的rMbovP579蛋白;灵敏性试验结果表明，试纸条能检测出15倍稀释的牛结核标准阳性血清及12倍稀释的牛支原体标准阳性血清;与牛常见传染病无交叉反应;稳定性试验结果显示，试纸条显色正常;检测40份已知背景的临床牛血清样本，结果表明，牛支原体阳性符合率86.67％,阴性符合率92％，总符合率90％;牛结核阳性符合率85％，阴性符合率100％,总符合率92.5％。 本研究制备的rMbovP579与RCE蛋白免疫原性好且纯度高，在单联试纸条基础上，建立的牛支原体/结核抗体胶体金双重免疫层析试纸条灵敏性与特异性良好，临床样本检测结果与ELISA试剂盒结果相比符合率高，具有良好的应用前景。
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