摘要
背景和目的: 慢性气道黏液高分泌（Chronic mucus hypersecretion,CMH）是慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）具有特殊病理生理改变的临床表型，常表现为症状重、急性发作频率高、预后差等，对患者造成显著的负面影响。 气道上皮细胞是气道分泌黏液的主要细胞。肺泡巨噬细胞是肺组织中数量最多、功能最重要的免疫细胞。气道上皮细胞在炎性细胞调控下发生的表型和功能改变是CMH发病的重要机制。外泌体在体内扮演着“邮差信使”的角色，通过传递如微小RNA（microRNA,miRNA）等信号分子，进行细胞间的信号调控，外泌体功能很大程度上取决于来源细胞。研究表明肺泡巨噬细胞外泌体可被上皮细胞内吞，从而发挥生物学效应。本课题组在前期实验中发现慢阻肺大鼠肺泡巨噬细胞可以增强气道上皮细胞的增殖和分泌能力，进一步检测发现肺泡巨噬细胞来源外泌体中miR-380含量明显上调，提示外泌体miR-380与慢阻肺和CMH密切相关。 本研究拟从肺泡巨噬细胞来源外泌体miR-380角度出发，通过体外细胞间信息交互模型结合体内动物实验探讨CMH的发病机制，以期为寻找新的干预治疗慢阻肺和CMH的方法以及实现转化走向临床奠定必要的理论基础。 方法: 1.采用香烟烟雾联合脂多糖的方法构建慢阻肺大鼠动物模型，从肺泡灌洗液中分离巨噬细胞并培养。从正常大鼠体内分离、提取和培养气道上皮细胞。 2.通过慢病毒转染miR-380模拟物（miR-380mimic）和抑制物（miR-380inhibitor）,制备不同丰度肺泡巨噬细胞来源外泌体miR-380,超速离心法提取外泌体，蛋白免疫印迹（Western blot，WB）和纳米颗粒跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）对外泌体进行鉴定。 3.提取不同丰度miR-380与气道上皮细胞共培养，Western blot和免疫荧光染色法（immunofluorescence staining assay,IFA）检测各组气道上皮细胞黏蛋白（Mucin，MUC）5AC、MUC5B、囊性纤维化跨膜传导调节子（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR）和窖蛋白（Caveolin,CAV）-1的表达，同时检测核转录因子-κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、Janus酪氨酸激酶（J anus kinase，JAK）以及CAV-1负性调节因子胆固醇调节元件结合（S terol-regulatory element binding proteins，SREBP）蛋白磷酸化水平。 4.在miR-380mimic组气道上皮细胞中加用NF-κB、MAPK、JNK、JAK信号通路抑制剂，Western blot和实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测MUC5AC、MUC5B、MUC5ACmRNA、MUC5BmRNA的表达差异，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测白细胞介素-1β（Inter leukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）的表达。 5.通过普通大鼠尾静脉注射过量miR-380以及慢阻肺模型大鼠尾静脉注射miR-380抑制剂（antagomir-miR-380），同时设立对照组，取材各组大鼠肺组织，Western blot和RT-qPCR检测各组大鼠肺组织MUC5AC、MUC5B、MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表达，Western blot检测NF-κB、MAPK、JNK、JAK、SREBP蛋白磷酸化水平，ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α表达，通过动物模型进一步验证细胞学实验结论。 结果: 1.与对照组及miR-380inhibitor组相比,miR-380mimic组气道上皮细胞MUC5AC、MUC5B表达显著增加，CFTR表达明显减少。 2.与对照组及miR-380inhibitor组相比，miR-380mimic组气道上皮细胞的NF-κB、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平明显升高，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达明显增加（P＜0.05）。而在miR-380mimic组中加入NF-κB、MAPK或JNK信号通路抑制剂后可观察到气道上皮细胞MUC5AC、MUC5B和炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达明显下调（P＜0.05）。 3.与对照组相比，经尾静脉注射外泌体miR-380后的普通大鼠肺组织MUC5AC、MUC5B的表达明显增加，NF-κB、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平以及IL-1β、IL-6、TNF-α的表达明显上调。 4.与对照组相比，经尾静脉注射antagomir-miR-380后的慢阻肺大鼠肺组织的MUC5AC、MUC5B的表达明显减少，NF-κB、MAPK、JNK蛋白磷酸化水平以及IL-1β、IL-6、TNF-α的表达也明显下调。 结论: 肺泡巨噬细胞可通过旁分泌外泌体miR-380调控气道上皮细胞功能，促进CMH进展，具体机制为:外泌体miR-380下调CFTR表达，促进MUC5AC、MUC5B分泌，同时激活NF-κB、MAPK、JNK信号通路以及增加炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达。antagomir-miR-380在慢阻肺大鼠体内可上调CFTR表达、降低黏蛋白分泌、抑制炎症反应水平，具有潜在治疗缓解慢阻肺和CMH的作用。
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