摘要
烟草青枯病在我国大多数烟草种植区发生严重，极大地影响烟叶的产量和品质。本研究从我国12个省市自治区的烟草青枯病样品中分离获得204株烟草青枯菌菌株，在分子鉴定，致病力测定的基础上进行了泛基因组分析，为深入探讨烟草青枯菌的变异进化机制、制定科学合理的病害防控策略打下基础。主要研究结果如下: （一）对全国不同省份204株烟草青枯菌菌株进行分子鉴定和生化型鉴定，发现所有菌株均为演化Ⅰ型，生化Ⅲ型。从中鉴定到7个序列变种:13、14、15、17、34、44和54,序列变种15（34.31％）为优势序列变种。根据63个菌株在三个烟草品种上的致病力测定结果将烟草青枯菌菌株分为强致病型、中致病型和弱致病型，其中强致病型菌株占28.57％,主要来自西南烟区，且同一序列变种青枯菌菌株的致病力存在明显差异，序列变种与致病力之间无明显相关性。 （二）对不同地理来源、致病力有差异的103株烟草青枯菌进行了三代测序（Oxford Nanopore Technologies,ONT）,基因组测序结果表明烟草青枯菌基因组由染色体（3.57～3.92Mb）和大质粒（1.75～2.18Mb）两部分组成。烟草青枯菌的泛基因组呈开放的结构，泛基因组中包含9008个非冗余基因，由核心基因组、附属基因组和特有基因组成，分别占整个泛基因组的36.29％、48.71％和15.00％。对泛基因组功能注释结果表明，核心基因组的功能主要与氧化还原过程、DNA的转录调控相关，非必须基因组的功能主要与DNA重组、整合和DNA介导的转座相关。对103株烟草青枯菌种群的SNP分析结果表明，平均每个菌株有36,740个SNP位点，绝大多数编码基因的SNP位点都小于50个，烟草青枯菌基因组中绝大多数基因的Ka/Ks＜1，表明烟草青枯菌基因组受到纯化选择。基于鉴定到的SNP位点构建SNP系统发育进化树，将99株烟草青枯菌分为4个主要的类群，相同序列变种的烟草青枯菌大多数聚类于同一分支，表明基于SNP构建的系统发育树更能反映出烟草青枯菌的进化关系。在103株烟草青枯菌基因组中发现2226个基因组岛，每个菌株含有18～25个基因组岛，基因组岛的功能注释结果表明，基因组岛携带的基因主要与DNA介导的翻译调控、转座以及转座子活性相关。根据毒力因子数据库（VFDB）对基因组岛的注释发现基因组岛携带10类毒力因子，包括1252个毒力基因，效应子转运系统相关毒力基因占比最大，为36.50％，其中Ⅲ型分泌系统在效应子转运系统相关毒力基因的占比为66.73％。每株烟草青枯菌平均含有60个Ⅲ型效应蛋白，在不同致病型烟草青枯菌中鉴定到8个与致病型存在相关性的Ⅲ型效应蛋白，其中RipBK、RipAZ2为强致病型菌株特有。对烟草青枯菌基因组中paaB和IsfA基因进行敲除，成功获得这两个基因的敲除转化子。致病力测定结果发现，接种敲除转化子的烟株病情指数显著低于接种野生型烟草青枯菌的烟株，表明paaB和IsfA基因与烟草青枯菌的致病相关。 上述研究结果丰富了我国烟草青枯菌基因组信息，揭示了烟草青枯菌分子变异和遗传进化的多样性，可为后续深入开展青枯菌与烟草互作分子机制研究提供基础。
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