摘要
岩沙海葵毒素(PLTX)属于海洋生物毒素中的聚醚类毒素，在自然界中分布广泛，可在鱼、蟹、贻贝等水产品中通过生物富集效应累积形成高浓度，甚至可扩散至空气中形成气溶胶污染，中毒主要表现为呼吸困难、惊厥、运动失调、嗜睡、虚脱、呕吐、消化道广泛出血、休克、甚至死亡等，对人类健康与水产品养殖等产生严重威胁。PLTX已经明晰的作用机制为结合并阻断Na+-K+-ATP泵，开放Na+通道，并可继发性地与Ca2+通道等相互作用引起细胞内H+、Ca2+等变化，使得细胞去极化，因而PLTX具有极强的神经、心血管活性，是已知最强烈的血管收缩剂，然而，已知的作用机制并不能完全解释PLTX复杂多样的急慢性毒性效应。核酸适配体是一类长度在10-100 nt左右的单链核苷酸序列，通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)获得，因其与靶标的高亲和力与特异性，以及易于筛选、合成等优势，被喻为化学抗体，在环境监测、临床检测、药物研发等方面发挥重要作用。目前，适配体在海洋生物毒素监测领域已有广泛的研究基础，巧合的是，这些人工合成的适配体在多种生物基因组中存在着相似甚至相同序列，因此本课题组推测基因组中存在着能够结合毒素的适配体序列区域，并将此命名为毒素的天然适配体。本研究首先采用单轮基因组SELEX方法(One-round Genomic SELEX,OG-SELEX)获得PLTX甲基化修饰的天然适配体，随后通过分子对接与分子动力学模拟等解析适配体与PLTX的结合机制，最后从PLTX与基因组中适配体序列相互作用的角度出发，利用多种细胞与分子实验鉴定出PLTX发挥毒性效应的新的作用模式。 目的: 1、获得PLTX高亲和力的甲基化修饰的天然适配体。2、解析适配体与PLTX相互作用的机制及甲基化修饰的作用。3、鉴定PTLX发挥毒性效应的新的作用模式。 方法: 1、在PLTX干预后，利用CCK8实验检测不同细胞的存活率，结合既往研究报道的结果，提取敏感度适中的HaCaT和CHO-K1细胞系基因组，经超声破碎、热变性与猝冷处理后获得序列长度为200-300 nt左右的核酸文库，将其设置为空白组、常规组、甲基化组，每组各3个重复文库，空白组文库与空磁珠孵育，常规组和甲基化组文库与偶联了PLTX的磁珠孵育，回收结合的ssDNA,进行高通量及甲基化测序，通过生物信息学分析获得候选适配体序列并利用BLI技术测定其亲和力。2、通过BLI及MST多浓度拟合方法精确测定适配体的KD值，随后，利用RNAfold预测二级结构并通过CD实验验证，利用GROMACS和Rosetta等构建PLTX和适配体的三维结构，进行分子对接和分子动力学模拟，解析适配体与毒素相互作用的机制，确定PLTX的作用靶点。3、利用miRanda和miRDB等数据库预测ceRNA网络，经生物信息分析确定PLTX作用靶点的下游为LINC01250/miR-3646/GSK3B信号通路，通过双荧光素酶报告基因检测系统验证LINC01250与miR-3646以及miR-3646与GSK3B 3''UTR的相互作用。随后，分别在HaCaT细胞中过表达LINC01250,同时过表达 LINC01250 与 miR-3646;干扰LINC01250,同时干扰 LINC01250 与 miR-3646,通过CCK8、细胞划痕、transwell小室迁移与侵袭等实验，分析细胞的表型变化，利用RT-qPCR、WB等实验分析比较各组细胞中相关RNA和蛋白表达变化，验证PLTX作用靶点的效应及下游信号通路的生物学功能。最后，对各组细胞进行PLTX干预，分析比较上述指标的变化情况，鉴定PLTX新的作用模式。 结果: 1、PLTX 作用于 HaCaT、Caco-2、CHO-K1 和 3T3-Swiss 细胞 24 h 后的 IC50值分别为 8.8×10-4、3.2×10-3、7.8×10-5、3.2×10-10μg/mL。磁珠固定毒素的效率为 90.38％,各平行筛选文库核酸回收率均在1.0‰-2.0‰之间，基因组比对率均在80％以上。 2、利用OG-SELEX筛选方法获得了一批与PLTX有高亲和力的天然适配体，其中未修饰的天然适配体H127、H128、H12、C1293和C1732的KD值分别为834、119、40.9和103 nM,甲基化修饰的天然适配体mC525和mC1512的KD值分别为199、12.0 nM,并且它们对应的未甲基化的适配体C525和C1512也能够结合PLTX,但是亲和力有一定程度的减弱，KD值分别为838和139 nM。这其中以mC1512、C1293和C1512的结合能力最强，利用BLI多浓度拟合精确测定它们的KD值分别为25.1、551和112 nM;而MST多浓度拟合测定的KD值分别为31.4、606和241 nM。 3、适配体mC1512、C1293和C1512的CD谱图均在280 nm和245 nm处出现正吸收峰和负吸收峰，证实其包含了B型双链结构，而它们均为ssDNA,说明有部分核苷酸在分子内部发生了碱基互补配对，形成了茎环结构，与二级结构预测的结果一致。 4、分子对接结果显示，适配体C1512与PLTX形成的氢键主要位于G9、C10、C12、T13、C14、A15,而适配体mC1512形成的氢键位点虽然少了C12,但是多出了C8,同时G9产生了更多数量的氢键，形成了与PLTX更为稳定的结合位点;分子动力学模拟结果显示，甲基化修饰后，适配体mC1512的RMSF值平均下降了0.2?左右，较C1512更为稳定，且与PLTX之间形成了更多的氢键，同时，mC1512能够与PLTX形成强度更高的非键相互作用，提示mC1512核酸序列为PLTX作用的关键靶点。 5、PLTX干预后，HaCaT细胞的增殖、损伤后修复、迁移和侵袭能力均受到抑制，且抑制水平在48 h内随干预时间及毒素浓度的升高而升高。PLTX干预24 h后，明显提高HaCaT细胞中LINC01250和GSK3B的表达，且在一定范围内，其提高程度随PLTX浓度升高而升高。 6、过表达miR-3646可以显著减弱含有野生型LINC01250报告质粒的荧光素酶活性，而不减弱含有突变型LINC01250-Mut报告质粒的荧光素酶活性，证实LINC01250与miR-3646以碱基互补配对方式结合，二者互为靶向作用关系;过表达miR-3646可以显著减弱含有野生型GSK3B 3''UTR报告质粒的荧光素酶活性，而不减弱含有突变型GSK3B 3''UTR-Mut报告质粒的荧光素酶活性，证实miR-3646与GSK3B 3''UTR以碱基互补配对方式结合，二者互为靶向作用关系。 7、在HaCaT细胞中过表达LINC01250后，GSK3B磷酸化水平降低，介导β-catenin的降解，抑制下游c-Myc、cyclin D1和PPARδ的表达，导致细胞增殖、迁移和侵袭能力抑制，继续过表达miR-3646后，各蛋白表达水平和细胞表型的改变有一定程度回复;干扰LINC01250后，GSK3B磷酸化水平升高，抑制β-catenin的降解，提高下游c-Myc、cyclin D1和PPARδ的表达，促进细胞增殖、迁移和侵袭能力，继续干扰miR-3646后，各蛋白表达水平和细胞表型的改变有一定程度回复。 8、PLTX干预细胞24 h后，过表达LINC01250可使GSK3B磷酸化水平进一步降低，β-catenin、c-Myc和PPARδ表达进一步下降，cyclin D1表达进一步呈下降趋势，细胞增殖、迁移和侵袭能力进一步抑制，继续过表达miR-3646后，各蛋白表达水平和细胞表型的改变有一定程度回复;干扰LINC01250可使GSK3B磷酸化水平升高，β-catenin、c-Myc、cyclin D1和PPARδ表达均升高，改善细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制状态，继续干扰miR-3646后，各蛋白表达水平和细胞表型的改变有一定程度回复。 结论: 本研究建立OG-SELEX方法，筛选获得了首个甲基化修饰的PLTX天然适配体，利用改进的计算机模拟方法，成功构建PLTX三维结构，解析了甲基化修饰提升适配体亲和力的结构基础，鉴定出PLTX作用的新靶点，阐释了毒素作用的新模式，为获得天然修饰的高亲和力适配体提供了新的方法遵循，同时也为探究海洋生物毒素作用的新机制提供了完整的新策略，将适配体从环境监测、疾病检测和药物研发等领域的应用进一步拓展至生物活性分子的作用机制解析领域。本研究具体结论如下: 1、筛选得到PLTX的天然适配体:OG-SELEX方法可应用于海洋生物毒素化学修饰的天然适配体筛选，以PLTX为例，成功获得了其甲基化修饰的适配体mC1512。 2、甲基化有利于适配体与PLTX的结合:甲基化修饰可提升适配体mC1512的稳定性，增加其与PLTX结合时形成的氢键数量，提高分子间整体的非键相互作用强度，提升亲和力水平，提示mC1512核酸序列为PLTX的关键作用靶点。 3、mC1512介导了PLTX的部分功能:PLTX可与基因组中mC1512序列相互作用以促进基因LINC01250的转录，并通过下游LINC01250/miR-3646/GSK3B信号通路对HaCaT细胞的增殖、迁移和侵袭发挥重要调控作用。
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